張 薇,智深深，榮長仙，李麗娟△

重慶市急救醫(yī)療中心：1.檢驗科；2.婦產(chǎn)科，重慶 400014

宮頸炎是國內(nèi)外常見的婦科疾病，發(fā)病率持續(xù)上升，發(fā)病年齡亦呈年輕化趨勢，嚴(yán)重影響女性的生活質(zhì)量[1-2]。支原體感染是引發(fā)宮頸炎的主要原因之一，有研究報道，與宮頸炎相關(guān)的支原體陽性率為50%以上，其主要類型是解脲脲原體(Uu)、微小脲原體(Up)、生殖支原體(Mg)和人型支原體(Mh)[3]。女性生殖道感染支原體后，多數(shù)情況下只是作為攜帶者，當(dāng)宿主抵抗力下降或黏膜受損時，支原體可侵入宮頸黏膜細胞引起宮頸炎，繼續(xù)向上蔓延引起子宮內(nèi)膜炎、卵巢炎、不孕，甚至導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)等[4]。

Uu和Mh的檢測在國內(nèi)外臨床實驗室開展較早，培養(yǎng)法是主要檢測方法，原理是Uu分解尿素、Mh分解精氨酸后，生成的堿性物質(zhì)引起pH值上升，使液體培養(yǎng)基由黃色變成紅色。該方法具有操作簡單、易推廣等優(yōu)點，但耗時較長，不能區(qū)分支原體類型，可受雜菌干擾造成假陽性，也是導(dǎo)致國內(nèi)抗菌藥物濫用和支原體耐藥率上升的原因之一[5]。為此，本課題組前期成功研發(fā)了基于環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增和微流控技術(shù)的生殖道支原體基因芯片，經(jīng)性能驗證后，采用該基因芯片檢測本院宮頸炎患者，判斷生殖道支原體感染類型，以期為臨床快速診斷和合理用藥提供參考價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年3-8月本院初診的156例宮頸炎患者為研究對象，宮頸炎診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《2015美國疾病控制和預(yù)防中心關(guān)于宮頸炎癥的診治規(guī)范》。納入標(biāo)準(zhǔn)：宮頸管流出膿性分泌物；進行拭子操作后宮頸出血；陰道分泌物鏡檢每高倍視野下白細胞計數(shù)>10個。排除標(biāo)準(zhǔn)：月經(jīng)期；24 h內(nèi)有性生活；3 d內(nèi)使用陰道藥物或進行陰道沖洗；1周內(nèi)服用抗菌藥物。

1.2儀器與試劑 生殖道支原體微流控芯片由本課題組研發(fā)；RTisochipTM-A恒溫擴增微流控芯片核酸分析儀由博奧生物有限公司提供；恒溫擴增試劑購自上海榮研生物有限公司；DNA提取試劑盒購自Tiangen公司；PCR試劑盒購自北京康為世紀(jì)有限公司；Uu和Mh分離鑒定試劑盒購自珠海麗珠有限公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 患者取膀胱截石位，會陰處常規(guī)消毒，陰道窺器暴露宮頸。無菌拭子插入宮頸管內(nèi)，輕輕旋轉(zhuǎn)3～5圈，取出拭子后立即放入無菌管，盡快送檢。

1.3.2芯片法 將拭子放入0.9%氯化鈉溶液中，擠壓、旋轉(zhuǎn)拭子數(shù)次，充分混勻后提取標(biāo)本核酸。配制恒溫擴增試劑，取9.0 μL恒溫擴增試劑和9.0 μL標(biāo)本的核酸提取液，混勻后離心。芯片加樣后于RTisochipTM-A恒溫擴增微流控芯片核酸分析儀上進行核酸擴增，50 min后判讀結(jié)果。

1.3.3培養(yǎng)法 將基礎(chǔ)液及試驗板于室溫復(fù)溫后，吸取50.0 μL基礎(chǔ)液加入試驗板上的空白對照孔。將含分泌物的拭子插入剩余的基礎(chǔ)液中，擠壓、旋轉(zhuǎn)拭子數(shù)次，充分混勻。取混勻后的基礎(chǔ)液加入試驗板余下各孔，每孔50.0 μL，輕輕震蕩至包被上的物質(zhì)溶解。所有孔滴加1滴無菌液狀石蠟，加蓋后置于37 ℃孵箱培養(yǎng)，Uu和Mh分別于24和48 h后觀察結(jié)果。

1.3.4測序法 按照PCR試劑盒操作流程進行操作。引物分別如下，Uu上游引物：5′-GCA ATC TGC TCG TGA AGT AC-3′；Uu下游引物：5′-CTA AGC CAT TTA CAC CTC AA-3′；Up上游引物：5′-GCA ATC TGC TCG TGA AGT AC-3′；Up下游引物：5′-CTA AGC CAT TTA CAC CTC AA-3′；Mg上游引物：5′-CCA TGT GCG CCC TGA TGG GG-3′；Mg下游引物：5′-TCA CGC TAC TAC GTT GCT TAT TTT GGT-3′；Mh上游引物：5′-ACC CTG AAT TTG AAA TCG TTG C-3′；Mh下游引物：5′-CAA ATA TTG AGC CTG CTT TTG CAC CA-3′。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，產(chǎn)物于測序儀上測序。

1.3.5患者信息收集 收集并分析患者的臨床信息包括年齡、孕次、產(chǎn)次、是否絕經(jīng)等。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行分析，計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1生殖道支原體芯片法檢測結(jié)果 156例標(biāo)本中，陽性78例(部分標(biāo)本同時存在兩種或兩種以上支原體感染，陽性率為50.0%)，其中Uu 18例(陽性率為11.5%)，Up 57例(陽性率為36.5%)，Mg 4例(陽性率為2.6%)，Mh 14例(陽性率為9.0%)。

2.23種方法檢測的陽性符合率比較 芯片法與測序法比較，Uu、Mg和Mh的陽性符合率均為100.0%，Up的陽性符合率為96.6%。芯片法與培養(yǎng)法比較，Mh的陽性符合率為93.3%；培養(yǎng)法中Uu陽性數(shù)為82例，而芯片法中Uu陽性數(shù)為18例，Up陽性數(shù)為57例，推測培養(yǎng)法檢測的是總的脲原體。見表1～2。

表1 支原體芯片法與測序法的陽性符合率比較

表2 支原體芯片法與培養(yǎng)法的陽性符合率比較

2.3宮頸炎患者發(fā)生支原體感染的影響因素 宮頸炎患者發(fā)生支原體感染與年齡、孕次、產(chǎn)次、是否絕經(jīng)無關(guān)(P>0.05)。見表3。

表3 宮頸炎患者支原體感染的影響因素分析

3 討 論

目前大部分實驗室對生殖道支原體感染的鑒定多依賴于培養(yǎng)法或PCR單項驗證，尚未對支原體分型進行同步、高效的鑒定評價[6]，因此本研究在這方面有一定的創(chuàng)新性。本課題組前期成功研發(fā)了基于環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增和微流控技術(shù)的生殖道支原體基因芯片，以不同分型支原體的特征片段制備引物探針，將標(biāo)本DNA擴增并熒光標(biāo)記，通過雜交后檢測的熒光強度來判斷支原體的類型，其特點是標(biāo)本需要量少、準(zhǔn)確性高，整個檢測過程在1 h內(nèi)完成[7]，在婦產(chǎn)科學(xué)、生殖醫(yī)學(xué)、泌尿?qū)W等學(xué)科具有可觀的臨床應(yīng)用前景，充分體現(xiàn)了基因芯片技術(shù)在生殖道感染診治中的優(yōu)越性。

本研究顯示，宮頸炎患者生殖道支原體的陽性率為50.0%，其中Uu陽性率為11.5%，Up為36.5%，Mg為2.6%，Mh為9.0%。意大利的一項多中心研究利用實時PCR技術(shù)檢測這4種支原體，有癥狀感染者中Uu陽性率為9.0%，Up為38.3%，Mg為0.6%，Mh為8.6%[8]，與本研究結(jié)果基本一致。然而，也有研究報道脲原體(包括Uu和Up)在宮頸處可能僅是定植，并不是宮頸炎的致病因素[9]，經(jīng)基因分型后，Uu和Up在不同人群中的分布亦有差異，普通人群以Up定植為主，而高危人群以Uu定植為主[10]。

目前支原體的培養(yǎng)法只針對Uu和Mh。Up是從Uu中分離出的一個新種，亦能分解尿素，因此推測培養(yǎng)法很難將Uu和Up區(qū)分開[11]，芯片法則提供了一個高準(zhǔn)確度的脲原體分型。本研究顯示，培養(yǎng)法中Uu陽性數(shù)為82例，而芯片法中Uu陽性數(shù)為18例，Up陽性數(shù)為57例，因此推測培養(yǎng)法檢測的是總的脲原體，并且少數(shù)雜菌也可導(dǎo)致假陽性結(jié)果。李平衛(wèi)等[12]報道了Up的感染率遠高于Uu，生殖道感染性疾病與Up具有明顯相關(guān)性，Uu大多存在于無癥狀攜帶者。因此，對生殖道支原體進行分型具有重要意義。芯片法與測序法比較，Uu、Mg和Mh的陽性符合率均為100.0%，Up的陽性符合率為96.6%，符合率較高。芯片法中有2例未檢出Up陽性，推測是由于測序法的靈敏度高于芯片法，導(dǎo)致該2例標(biāo)本測序法結(jié)果為陽性但芯片法為陰性。鑒于培養(yǎng)法可獲得藥敏試驗結(jié)果，因此在診斷泌尿生殖道支原體感染時建議聯(lián)合使用培養(yǎng)法和芯片法。

此外，有研究報道年齡、性生活、流產(chǎn)、分娩史等是女性患宮頸炎的危險因素[13-14]，但本研究中宮頸炎患者發(fā)生支原體感染與年齡、孕次、產(chǎn)次、是否絕經(jīng)無關(guān)，可能是樣本量較少的緣故。宮頸支原體感染需引起女性重視，臨床醫(yī)生也要充分評估其配偶感染的危險因素，以提高支原體感染的診治水平[15]。

關(guān)于生殖道支原體感染的臨界值暫未設(shè)定，無法區(qū)分是定植還是感染，目前只能結(jié)合臨床癥狀和藥敏試驗結(jié)果給予針對性的治療?；蛐酒夹g(shù)提高了檢測方法之間的符合率，適宜臨床應(yīng)用推廣。后續(xù)，本課題組將繼續(xù)收集標(biāo)本，進行生殖道支原體定植和感染的研究。

綜上所述，生殖道支原體基因芯片可準(zhǔn)確、快速地檢測支原體及進行分型，具有可觀的臨床應(yīng)用價值。