齊永志，于銘釗，劉 敏，樂 宇

解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心檢驗科，北京 100048

甲狀腺疾病是內(nèi)分泌系統(tǒng)的常見疾病，近年來我國甲狀腺疾病發(fā)病率明顯升高[1-2]。中華醫(yī)學(xué)會內(nèi)分泌學(xué)分會撰寫的《中國甲狀腺疾病診治指南》中對甲狀腺功能實驗室檢查指標(biāo)進行了探討，認(rèn)為血清總甲狀腺素(TT4)、總?cè)饧紫僭彼?TT3)是反映甲狀腺功能狀態(tài)的最佳指標(biāo)，其中TT4在甲狀腺功能減退的診斷中起關(guān)鍵作用[3]。筆者在臨床工作中發(fā)現(xiàn)少數(shù)標(biāo)本TT4檢測結(jié)果升高，與甲狀腺功能其他指標(biāo)結(jié)果相矛盾，給臨床診斷和治療帶來困難。本研究對TT4結(jié)果異常標(biāo)本在不同的免疫分析儀上進行了比較，初步分析了干擾貝克曼DXI800全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(簡稱DXI800分析儀)檢測TT4的相關(guān)因素。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年8月至2019年3月解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心門診及住院進行甲狀腺功能檢測的患者150例。選取TT4、TT3、游離三碘甲腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)、促甲狀腺激素(TSH)水平均正常的患者50例為TT4正常組。其中男13例，女37例；年齡25～91歲，平均(44.2±11.8)歲。選取DXI800分析儀檢測TT4水平升高、TSH水平降低的患者50例為TT4正常升高組。其中男13例，女37例；年齡25～91歲，平均(49.0±13.4)歲。選取DXI800分析儀檢測TT4水平升高，TT3、FT3、FT4、TSH水平正常的患者50例為TT4異常升高組。其中男9例，女41例，年齡25～91歲；平均(50.6±18.5)歲。

1.2儀器與試劑 DXI800分析儀及相應(yīng)配套TT4檢測試劑盒、AU5821全自動生化分析儀(簡稱AU5821分析儀)及相應(yīng)配套類風(fēng)濕因子(RF)檢測試劑盒均購自美國貝克曼庫爾特公司；ARCHITECT I4000全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(簡稱I4000分析儀)及相應(yīng)配套TT4試劑盒購自美國雅培公司。所用校準(zhǔn)品均為廠家提供的相應(yīng)配套校準(zhǔn)品，免疫多項質(zhì)控品(批號40340)、特種蛋白多項質(zhì)控品(批號66380)均購自美國Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1TT4檢測 兩種化學(xué)發(fā)光免疫分析儀分別對TT4進行檢測，將廠家試劑盒說明書提供的生物參考區(qū)間作為結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)，超過參考區(qū)間上限為檢測結(jié)果升高。貝克曼庫爾特公司試劑盒說明書提供的TT4生物參考區(qū)間為70.0～152.0 nmol/L；雅培公司試劑盒說明書提供的TT4生物參考區(qū)間為62.8～151.2 nmol/L。

1.3.2RF檢測 在AU5821分析儀上測定3組的RF水平，操作人員熟練掌握檢測方法，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行，檢測方法為免疫透射比濁法，超過試劑盒說明書提供的生物參考區(qū)間上限(14 IU/mL)為RF檢測結(jié)果升高，檢測線性為10～120 IU/mL。

1.3.3堿性磷酸酶(ALP)檢測 選取在DXI800分析儀上TT4水平升高，I4000分析儀上TT4水平正常的16份標(biāo)本為試驗組進行ALP水平測定，同時選取TT4正常組和TT4正常升高組中的標(biāo)本各16份為對照1組和對照2組，也進行ALP水平測定。檢測儀器為AU5821分析儀，檢測方法為速率法，以試劑盒說明書提供的生物參考區(qū)間(30～120 U/L)為結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)，檢測線性為5～1 500 U/L。

1.3.4ALP抗體阻斷試驗 選取上述試驗組中的11份標(biāo)本進行ALP抗體阻斷試驗。ALP抗體阻斷劑(sALP)購自日本Osaka biochemical plant公司，水平為5 mg/mL。進行平行試驗，分成3組：原液組、磷酸鹽緩沖液(PBS)組、sALP去干擾組。原液組選取300 μL標(biāo)本原液，PBS組選取270 μL標(biāo)本原液再加入30 μL PBS，sALP去干擾組選取270 μL標(biāo)本原液再加入30 μL sALP。室溫孵育30 min，1 000 r/min離心30 s，采用DXI800分析儀對3組標(biāo)本TT4水平進行檢測。

2 結(jié) 果

2.1兩種儀器對TT4正常組、TT4正常升高組標(biāo)本檢測結(jié)果的比較 對兩種儀器TT4檢測數(shù)據(jù)進行McNemar檢驗，兩種檢測儀器對TT4水平升高的判斷比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.289)，一致性檢驗Kappa=0.84(P<0.05)，兩種檢測儀器對TT4水平升高的判斷一致性較好。見表1。

表1 兩種儀器檢測TT4正常組、TT4正常升高組標(biāo)本的結(jié)果比較(n)

2.2兩種儀器對TT4正常組、TT4異常升高組標(biāo)本檢測結(jié)果的比較 對兩種儀器TT4檢測數(shù)據(jù)進行McNemar檢驗，兩種檢測儀器對TT4水平升高的判斷差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)。見表2。

2.3各組RF檢測結(jié)果比較 TT4正常組、TT4正常升高組、TT4異常升高組的RF檢測結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表2 兩種儀器檢測TT4正常組、TT4異常升高組標(biāo)本的檢測結(jié)果比較(n)

表3 RF檢測結(jié)果在各組中比較(n)

2.4各組ALP水平比較 對照1組、對照2組、試驗組ALP水平分別為(76.7±23.6)U/L、(77.0±21.5)U/L和(78.1±27.1)U/L，經(jīng)單因素方差分析，3組ALP水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.014，P=0.986)。

2.5ALP抗體阻斷試驗后TT4水平比較 sALP去干擾組和PBS組TT4檢測結(jié)果比較[(166.89±32.17)nmol/Lvs. (193.51±26.03)nmol/L]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-2.275，P=0.046)，PBS組和原液組TT4檢測結(jié)果比較[(193.51±26.03)nmol/Lvs. (185.46±32.70)nmol/L]，差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.695，P=0.023)。其中2份標(biāo)本經(jīng)sALP去干擾后TT4檢測結(jié)果落入生物參考區(qū)間內(nèi)。

3 討 論

臨床實驗室對TT4水平的檢測大多采用抗原抗體反應(yīng)，但采用的指示系統(tǒng)不同：放射免疫比濁法采用的是放射性同位素標(biāo)記；臨床常用的化學(xué)發(fā)光法可以用發(fā)光物質(zhì)直接標(biāo)記，也可采用酶類標(biāo)記，稱為酶聯(lián)免疫化學(xué)發(fā)光法；而電化學(xué)發(fā)光法采用三聯(lián)吡啶釕進行標(biāo)記[4]。本研究中DXI800分析儀采用ALP標(biāo)記TT4，標(biāo)本中TT4與試劑中的鼠源性TT4抗體競爭性結(jié)合，抗原抗體復(fù)合物可與包被磁微粒的捕獲抗體(羊抗鼠抗體)結(jié)合，產(chǎn)生的光量子值與標(biāo)本內(nèi)的TT4水平呈反比，以此測定TT4水平。I4000分析儀采用吖啶酯進行標(biāo)記，吖啶酯標(biāo)記的TT4與標(biāo)本中的TT4競爭結(jié)合試劑中的羊抗人TT4抗體，檢測抗體直接包被的磁微粒，以此測定TT4水平。兩種儀器標(biāo)記物的不同，以及DXI800分析儀捕獲抗體的加入，均可能導(dǎo)致兩種儀器抗干擾能力及檢測結(jié)果的差異。

本研究依據(jù)DXI800分析儀的檢測結(jié)果篩選出可能受干擾的標(biāo)本，進一步試驗確定干擾因素，試驗?zāi)康牟⒉皇潜容^兩種檢測儀器抗干擾能力的差異，試驗結(jié)果也不能說明兩種儀器整體抗干擾能力的優(yōu)劣?，F(xiàn)階段TT4免疫定量分析缺乏統(tǒng)一溯源，不同檢測儀器檢測結(jié)果在數(shù)值上不具有可比性，在國家衛(wèi)生健康委員會組織的室間質(zhì)量評價中，TT4化學(xué)發(fā)光定量檢測也是按儀器進行分組，這是本研究中沒有應(yīng)用配對樣本t檢驗對不同檢測儀器數(shù)據(jù)進行處理的原因。不同檢測儀器通過相應(yīng)的生物參考區(qū)間進行判讀，結(jié)果應(yīng)該基本一致，TT4正常組和TT4正常升高組的數(shù)據(jù)分析也表明兩種檢測儀器一致性較好，Kappa值為0.84。50例DXI800分析儀檢測TT4水平升高標(biāo)本中，有16例在I4000分析儀上檢測正常，兩種檢測儀器對TT4水平升高的判斷結(jié)果差異較大，說明兩種檢測儀器的抗干擾能力可能不同。

RF對抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)生干擾的報道較多，對酶聯(lián)免疫吸附法和化學(xué)發(fā)光法均可產(chǎn)生干擾，主要原理是RF可以與檢測抗體(動物來源)的Fc段結(jié)合，干擾抗體與檢測物的結(jié)合[5-6]。本研究中RF水平檢測采用免疫透射比濁法，檢測線性為10～120 IU/mL，當(dāng)檢測結(jié)果<10 IU/mL時超出了檢測線性范圍，而RF生物參考區(qū)間為0～14 IU/mL，在RF檢測結(jié)果正常的標(biāo)本中，大部分結(jié)果<10 IU/mL，所以數(shù)據(jù)按照計數(shù)資料進行分析。本研究對TT4正常組、TT4正常升高組、TT4異常升高組進行RF水平檢測，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明RF不是TT4結(jié)果異常升高的主要原因。

從檢測原理分析，DXI800分析儀標(biāo)記物是ALP，如果標(biāo)本ALP水平過高，可能干擾試驗，但對I4000分析儀不產(chǎn)生干擾。當(dāng)DXI800分析儀檢測方法為雙抗體夾心法時，檢測信號值與檢測物水平呈正比，標(biāo)本中的ALP可造成檢測信號升高，使檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性。多項研究表明，內(nèi)源性ALP可造成肌鈣蛋白I、人絨毛膜促性腺激素假陽性[7-9]。當(dāng)DXI800分析儀TT4檢測采用免疫競爭法時，檢測信號值與檢測物水平呈反比，如果標(biāo)本中存在高水平的ALP會造成TT4檢測結(jié)果降低，而不是比真實水平升高，在DXI800分析儀采用免疫競爭法檢測睪酮的研究中發(fā)現(xiàn)，患者服用合成的ALP治療后會造成睪酮檢測值降低[10]。本研究中對照1組、對照2組、試驗組ALP水平檢測結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明TT4異常升高組標(biāo)本中ALP水平?jīng)]有明顯升高，在本研究中ALP不是造成TT4檢測結(jié)果異常升高的原因。

有研究表明，人體內(nèi)存在ALP抗體會造成雌二醇檢測結(jié)果偏高，加入sALP后，檢測結(jié)果明顯降低[11]。該研究也在被測標(biāo)本中加入不同水平的ALP抗體，證明ALP抗體的存在對DXI800分析儀造成干擾，但不同水平、不同種類的ALP抗體可能會使雌二醇檢測結(jié)果偏高或偏低[11]。對于免疫競爭法檢測TT4，一方面ALP抗體可結(jié)合到T4-ALP復(fù)合物上，影響酶結(jié)合物催化底物發(fā)光，另一方面ALP抗體與T4-ALP結(jié)合后，可能阻止T4-ALP復(fù)合物與抗T4抗體的結(jié)合。兩種機制均可造成信號值降低，最終使TT4檢測結(jié)果異常升高。sALP中含有滅活的ALP，可與標(biāo)本中的ALP抗體結(jié)合，消除干擾。本研究中采用sALP去干擾后，TT4水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，同時兩份標(biāo)本經(jīng)sALP去干擾后結(jié)果變?yōu)檎?，說明ALP抗體的存在對部分標(biāo)本TT4的檢測有干擾，可能影響到臨床的診斷和治療。

此外，若患者體內(nèi)存在人抗鼠抗體，可以和捕獲抗體(羊抗鼠抗體)競爭結(jié)合鼠源性檢測抗體，可導(dǎo)致抗原抗體復(fù)合物不能被捕獲抗體捕獲，光量子值降低，最終TT4檢測值升高。含有鼠免疫球蛋白的阻斷劑可以特異性地去除人抗鼠抗體的干擾，但考慮到多余的阻斷劑可與捕獲抗體結(jié)合，難以去除，所以本研究并未進行異嗜性抗體阻斷試驗，后續(xù)研究可進一步對標(biāo)本中人抗鼠抗體進行直接檢測，以證明異嗜性抗體干擾的存在。

綜上所述，標(biāo)本中ALP抗體的存在可能是DXI800分析儀檢測TT4水平異常升高的原因之一，采用不同檢測儀器復(fù)查，同時結(jié)合患者臨床癥狀分析，可有效減少不同干擾因素引起的異常結(jié)果。