楊 倩，戚 超，徐 婷，姚春艷

陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院輸血科，重慶 400038

ABO血型系統(tǒng)是人類最重要的血型系統(tǒng)，除了A型、B型、O型、AB型這4種常見血型外，還有一些罕見的抗原較弱的亞型，比如B(A)血型[1]。B(A)血型在人群中的出現(xiàn)頻率約為1/50萬，該人群血清中存在高度活性的B型糖基轉(zhuǎn)移酶，同時也存在少量的A型糖基轉(zhuǎn)移酶，因此，其紅細胞上不僅存在B抗原，還存在很弱的A抗原[2]。B(A)血型被認為是遺傳學(xué)上的B型，血清學(xué)檢測結(jié)果多表現(xiàn)為AB型，嚴重影響血型鑒定的準(zhǔn)確性和輸血安全[3-4]。本文對1例B(A)血型正反定型不符的患者進一步行血清學(xué)及分子生物學(xué)檢測，同時對其進行了家系調(diào)查分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 先證者，秦某，31歲，女，漢族，原發(fā)不孕，無輸血史，術(shù)前血型檢查中發(fā)現(xiàn)常規(guī)血清學(xué)鑒定正反定型不符。經(jīng)患者及其父母同意后，筆者對該患者進行了分子生物學(xué)分析及家系調(diào)查。

1.2儀器與試劑 主要儀器：LC-10C血庫配血專用離心機(安徽中科中佳)，F(xiàn)QD-96A熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(杭州博日科技)，3130基因測序儀(美國ABI)。試劑：單克隆抗-A、抗-B血型定型試劑(上海血液生物20171023)，單克隆抗-H、抗-A1定型試劑(江蘇力博20180918)，人ABO血型反定型用紅細胞試劑(江蘇力博201807006)，抗體篩查細胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ號(江蘇力博201808009)，DNA提取試劑盒(江蘇中濟萬泰生物)，人類紅細胞ABO血型基因分型試劑盒(江蘇中濟萬泰生物)，ABO1-7外顯子測序試劑盒(江蘇中濟萬泰生物)。

1.3方法

1.3.1血型鑒定 采用試管法進行ABO血型血清學(xué)鑒定，采用抗人球蛋白法進行先證者血清的抗體篩查試驗和抗人球蛋白試驗。以上操作參照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》(第3版)[5]進行操作。

1.3.2DNA提取 使用DNA提取試劑盒(江蘇中濟萬泰生物)快速抽提乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血中的基因組DNA，DNA標(biāo)本水平為60 ng/mL，純度為1.6～2.0(A260/A280)。

1.3.3ABO基因分型 采用熒光定量PCR法進行ABO基因分型(采用人類紅細胞ABO血型基因分型試劑盒)，按照試劑盒說明書進行檢測。

1.3.4ABO基因第6、7外顯子直接測序 采用ABO1-7外顯子測序試劑盒，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2 結(jié) 果

2.1血清學(xué)鑒定結(jié)果分析 先證者及其父母的血型血清學(xué)鑒定結(jié)果見表1。通過血清學(xué)鑒定試驗發(fā)現(xiàn)，先證者父親為A型，母親為B型，先證者為可疑B(A)型。先證者的血清學(xué)檢測結(jié)果不符合遺傳定律，因此需要進一步對該家系進行分子生物學(xué)檢測。

2.2抗體篩查及抗人球蛋白試驗結(jié)果分析 先證者及其父母的抗體篩查試驗結(jié)果均為陰性，排除存在ABO血型系統(tǒng)以外不規(guī)則抗體的可能性；直接抗人球蛋白試驗結(jié)果均為陰性，表明不存在紅細胞上黏附的自身抗體對血型正定型造成干擾的現(xiàn)象；間接抗人球蛋白試驗結(jié)果均為陰性，可排除血清中存在干擾反定型檢測的不利因素。

2.3ABO基因分型結(jié)果分析 通過熒光定量PCR法進行ABO基因分型檢測，A、A205、B、O(261G缺失)、O1、O2特異性引物只擴增引物3′末端的第1個堿基互補的等位基因，而不擴增不互補的等位基因，1次擴增就可以區(qū)分ABO的等位基因。PCR摻入染料法將熒光染料通過摻入DNA的擴增產(chǎn)物來表示DNA的擴增效果。在擴增后進行熔解曲線分析，通過熔解曲線分析能確認目的產(chǎn)物是否被特異性擴增，以此判斷ABO的等位基因。從熔解曲線來看，先證者B基因和O02基因被特異性擴增，先證者父親A基因和O02基因被特異性擴增，先證者母親只有B基因被特異性擴增，故先證者的基因分型結(jié)果為BO02，其父親的基因型結(jié)果為AO02，其母親的基因型結(jié)果為B/B。

表1 先證者及其父母ABO血型血清學(xué)檢測結(jié)果

2.4ABO基因第6、7外顯子直接測序結(jié)果分析 對ABO基因的第6和第7外顯子直接測序，發(fā)現(xiàn)先證者及其母親存在261G/delG、297A/G、526G/C、640A/G、646T/A、657C/T、681G/A、703G/A、771C/T、796C/A、803G/C、829G/A和930G/A雜合。與標(biāo)準(zhǔn)序列比對，發(fā)現(xiàn)先證者存在B(A)04等位基因640A>G突變。先證者及其父親存在特征性721C>T雜合，經(jīng)與血型抗原基因突變數(shù)據(jù)庫比對，未發(fā)現(xiàn)有相同突變位點的O型等位基因，表明先證者及其父親均含有1條新的O型等位基因。見表2。

表2 先證者及其父母ABO基因第6、7外顯子直接測序結(jié)果

2.5ABO基因突變位點截圖 見圖1。

注：A、B為先證者特異性突變位點；C為先證者父親特異性突變位點；D為先證者母親特異性突變位點。

2.6家系調(diào)查 先證者家系的血型基因分型結(jié)果見圖2。

圖2 先證者家系的血型基因分析

3 討 論

ABO血型基因共有7個外顯子和6個內(nèi)含子，位于第9號染色體長臂3區(qū)4帶1、2亞帶(9q34.1～9q34.2)[6-7]，核苷酸序列高度保守，等位基因之間只有幾個核苷酸的差異，具有高度同源性。其中第6、7外顯子約占編碼區(qū)長度的77%，編碼91%的糖基轉(zhuǎn)移酶活性區(qū)域[8]，決定著ABO基因一級產(chǎn)物糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性與性質(zhì)。糖基轉(zhuǎn)移酶活性的減弱或特異性改變將最終導(dǎo)致A或B抗原的減弱或轉(zhuǎn)變，從而產(chǎn)生ABO亞型[9-10]。

ABO血型正定型的凝集強度通常應(yīng)為3～4個“+”，反定型則應(yīng)該至少超過2個“+”，若結(jié)果異常，則判定為正反定型不符，應(yīng)該從標(biāo)本及試劑質(zhì)量、紅細胞亞型、疾病(導(dǎo)致抗原或抗體減弱)等因素進行全面分析[11]。在本研究中，先證者的標(biāo)本經(jīng)過2次采集，病史回顧無特殊。正定型試驗中，紅細胞表面的A抗原較弱，B抗原正常，H抗原增強；反定型試驗中，血清與A1細胞凝集，為4個“+”，與B細胞不凝集,結(jié)果判定為正反定型不符。為明確其血型，進一步對先證者進行了家系調(diào)查。

先證者父親的基因分型結(jié)果為AO02，測序結(jié)果有突變位點721C>T雜合，結(jié)合血清學(xué)結(jié)果抗-A 4個“+”，推斷其一條等位基因為A102，另一條等位基因為O02的新基因型(721C>T)。先證者母親的基因分型結(jié)果為B/B，測序結(jié)果有突變位點640A>G雜合，其一條等位基因為B(A)04(640A>G)，另一條等位基因為B101。先證者的基因分型結(jié)果為BO02，測序結(jié)果有突變位點640A>G雜合，721C>T雜合。從家系分析推斷：先證者一條等位基因為B(A)04(640A>G)，另一條等位基因為O02的新基因型(721C>T)。先證者存在的nt640 A>G錯義突變使214位甲硫氨酸被纈氨酸置換，從而導(dǎo)致了B等位基因具有編碼A抗原和B抗原雙功能活性酶的能力[11]。對于另一條O02的新基因型(721C>T)等位基因，從先證者及其父親的血清學(xué)檢測結(jié)果來看，此突變可能為同義突變，不具有生物學(xué)意義。由此判斷先證者血清學(xué)正反定型不符是由640A>G突變引起的。對于先證者母親，測序基因型為B(A)04/B，但其血型血清學(xué)結(jié)果顯示正反定型相符，并沒有表現(xiàn)出較弱的A抗原?？赡艿脑蛴袃蓚€：(1)此基因型表現(xiàn)為大量的B抗原和極少量的A抗原，在血清學(xué)試驗中極少量的A抗原被大量的B抗原掩蓋，故正定型為B型。(2)國產(chǎn)的單克隆抗體試劑存在對B(A)血型的漏檢現(xiàn)象。存在這種現(xiàn)象的原因是單克隆ABO血型定型試劑采用雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)，針對的是1種血型抗原的單個抗原決定簇，無法識別所有的ABO血型抗原，尤其是ABO血型系統(tǒng)的弱A、弱B抗原。B(A)亞型抗原表位上功能基因的不同、位置的差異，甚至立體構(gòu)象的變化等，都無法被單克隆抗體識別，從而出現(xiàn)漏檢的情況[1]。

在日常實驗室工作中，若遇到血清學(xué)方法無法確定的疑難血型標(biāo)本，應(yīng)采用基因分型技術(shù)進一步鑒定，必要時需進行家系調(diào)查，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，保障臨床用血安全。