華金仁，劉榮芳，葉婷婷，潘玫

伴隨對子宮內(nèi)膜癌認(rèn)知的提升，其治療方案也日漸完善，但對于晚期子宮內(nèi)膜癌患者，仍需采用放療、化療等進(jìn)行治療，其中化療已成為人們最為重視的一種治療方法。對于部分特殊的患者，如手術(shù)治療后具有較高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)或已復(fù)發(fā)的患者，則需在手術(shù)治療后聯(lián)合應(yīng)用放化療，以便能夠更好地抑制癌細(xì)胞，降低其復(fù)發(fā)率，延長生存時(shí)間［1-2］。水飛薊素為一種抗氧化劑，臨床上廣泛用于預(yù)防銀屑病、膽管炎、脂肪肝等疾病，而且具有抑制宮頸癌、乳腺癌細(xì)胞分化生長的效果。為進(jìn)一步明確其作用機(jī)制，本研究將水飛薊素用于子宮內(nèi)膜癌治療中，評價(jià)其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 樣本來源為上海復(fù)祥生物科技有限公司提供的人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞株，哈藥集團(tuán)生物工程有限公司提供的水飛薊素注射液，杭州四季青提供的胎牛血清，GIBCO 公司提供的RPMI-1640 培養(yǎng)液，美國Sigma 公司提供的0.05%胰蛋白酶，武漢博士德生物工程有限公司提供的四唑鹽（MTT）細(xì)胞增殖試劑盒和雙抗（青-鏈霉素），北京康威士忌生物科技有限公司提供的兔抗人Caspase-3 多克隆抗體。儀器為北京市新技術(shù)應(yīng)用研究所提供的超凈工作臺、二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱、光學(xué)顯微鏡，SANYO 公司提供的電冰箱，上海光學(xué)儀器廠提供的倒置顯微鏡、凍存管、酶聯(lián)免疫檢測儀、離心管，美國BD 公司提供的流式細(xì)胞儀。

1.2 研究方法 選取2019 年1 月—2020 年4 月江西省婦幼保健院收治的60 例子宮內(nèi)膜癌患者，取患者的人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞株，對照組中不增加任何藥物，觀察組增加水飛薊素，應(yīng)用MTT 比色法檢驗(yàn)水飛薊素對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞活性影響，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，使用免疫組化法檢驗(yàn)Caspase-3 表達(dá)水平。

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取6 mg/ml 水飛薊素注射液，以原液形式保存在4 ℃冰箱內(nèi)，使用時(shí)稀釋至所需濃度。將人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞株自液氮內(nèi)取出，置入37 ℃ 水浴箱溶解，按1 000 r/min 離心5 min，取凍存液，置入預(yù)先配置好的濃度為10%胎牛血清和1%雙抗RPMI-1640 培養(yǎng)基，混合均勻，于培養(yǎng)瓶接種細(xì)胞懸液，放于溫度為37 ℃的環(huán)境中，保持恒溫，以5%規(guī)格的二氧化碳培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至傳代水平后，進(jìn)行細(xì)胞凍存處理，待用。1.2.2 MTT 法檢驗(yàn)水飛薊素誘導(dǎo)人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞凋亡情況 取數(shù)對生長期細(xì)胞，去除培養(yǎng)液后使用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，以0.05%胰蛋白酶進(jìn)行消化，加入培養(yǎng)液，終止消化。調(diào)整細(xì)胞數(shù)，保持3 ×104個(gè)/ml，于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上接種細(xì)胞混懸液，100 μl/孔。于培養(yǎng)箱（37 ℃、5%二氧化碳）中孵育，時(shí)間為24 h，此后丟棄上清液，設(shè)置含有細(xì)胞、培養(yǎng)基的對照組，與含50 μg/ml 的觀察組，每個(gè)孔內(nèi)加入150 μl 的藥物，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔。放入培養(yǎng)箱中，時(shí)間為48 h，然后采用倒置顯微鏡仔細(xì)觀察，結(jié)束后，于避光條件下，在每個(gè)孔內(nèi)加入MTT 染色液10 μl，放置于培養(yǎng)箱中，時(shí)間為4 h。此后，每個(gè)孔加入溶解液100 μl 置入搖床上低速震蕩半小時(shí)，充分溶解結(jié)晶物。在酶聯(lián)免疫檢測儀中測定各個(gè)孔的吸光度值。

1.2.3 人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞凋亡率檢驗(yàn) 方法：流式細(xì)胞儀檢驗(yàn)，操作流程：取數(shù)對生長期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，接種在6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每個(gè)孔內(nèi)加入2 ml藥物制成的培養(yǎng)液，放置于培養(yǎng)箱中，設(shè)置對照組（不加入藥物）、觀察組（6 μg/ml），置入培養(yǎng)箱（37 ℃、5%二氧化碳）內(nèi)，培養(yǎng)24 h 后去廢液，以無菌PBS 洗滌2 次，再以0.05%胰蛋白酶進(jìn)行消化，終止培養(yǎng)液。以1 000 r/min 離心5 min，結(jié)束后，丟棄上清液，加入BS重懸細(xì)胞2 ml，300 目尼龍網(wǎng)過濾，再次重復(fù)上述操作，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml。檢驗(yàn)細(xì)胞凋亡率，獲得細(xì)胞熒光信號（對數(shù)方式），搜集標(biāo)本熒光信號（FL1、FL2 模式），并運(yùn)用Cellquest 軟件處理。

1.2.4 Caspase-3 表達(dá)水平 方法：免疫組化法檢驗(yàn)，操作流程：對照組常規(guī)處理，觀察組待檢測標(biāo)本，顯色1～5 min 后，以切面蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、干燥、封固（中性樹膠），操作結(jié)束后，運(yùn)用顯微鏡觀察標(biāo)本，陽性判定標(biāo)準(zhǔn)為：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色顆粒。分?jǐn)?shù)判定標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)、染色深度，陽性細(xì)胞數(shù)＜1%者為0 分，1%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3 分，≥76%為4 分。染色強(qiáng)度：無色則計(jì)0 分，淺黃色計(jì)1 分，棕黃色計(jì)2 分，棕褐色計(jì)3 分。二者相乘獲得最終得分。

1.3 觀察指標(biāo)（1）觀察對照組和觀察組對人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞增殖以及細(xì)胞凋亡率的影響。（2）對比對照組和觀察組人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞Caspase-3 表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以表示，比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對照組和觀察組對人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞增殖影響 觀察組人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞吸光度低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見表1。

表1 對照組和觀察組對人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞增殖影響（）

表1 對照組和觀察組對人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞增殖影響（）

2.2 對照組和觀察組對人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞凋亡影響 觀察組人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞凋亡率高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見表2。流式細(xì)胞儀結(jié)果見圖1、2。

圖1 對照組對人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞凋亡影響

表2 對照組和觀察組對人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞凋亡影響（，%）

表2 對照組和觀察組對人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞凋亡影響（，%）

2.3 對照組和觀察組對人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞Caspase-3 表達(dá)水平影響 觀察組中人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞Caspase-3 表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見表3。

表3 對照組和觀察組對人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞Caspase-3 表達(dá)水平影響（）

表3 對照組和觀察組對人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞Caspase-3 表達(dá)水平影響（）

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)第三大惡性腫瘤，其發(fā)生率呈現(xiàn)出全球增長的趨勢，對我國乃至全球女性生殖系統(tǒng)的健康均構(gòu)成了威脅。

近幾年來，隨著學(xué)者對癌癥的不斷深入研究，各種癌癥的治療方案均取得了較為有效的進(jìn)展，而婦科醫(yī)學(xué)中，子宮內(nèi)膜癌也取得了較好的效果，但仍需面臨諸多問題，比如化療藥物敏感性等。腫瘤是由于各種活性氧、氧化鳥嘌呤，形成8-羚基鳥嘌呤，損傷DNA，進(jìn)而使得染色體的轉(zhuǎn)化發(fā)生變化而導(dǎo)致，運(yùn)用抗氧化劑，尤其是自由基清除劑，可在一定程度上預(yù)防這一過程中的發(fā)生，進(jìn)而達(dá)到治療的目的［3-4］。水飛薊素是一種抗氧化劑，是從乳薊（Milk Thistle）中提煉出來，對于肝癌、前列腺癌、乳腺癌等多種癌細(xì)胞均具有較好的生長抑制、分化抑制的作用［5］。

圖2 觀察組對人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞凋亡影響

祖木熱來提? 艾尼瓦爾等［6］認(rèn)為，凋亡受阻極大可能是一種子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生機(jī)制，細(xì)胞凋亡可能存在負(fù)調(diào)節(jié)作用。子宮內(nèi)膜癌組織內(nèi)，Caspase-3 呈低表達(dá)狀態(tài)，這一點(diǎn)可能是子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的原因之一［7］。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞為了適應(yīng)環(huán)境，而進(jìn)行的一種主動(dòng)過程，這期間涉及基因的激活、表達(dá)、調(diào)控等。Caspase 可激活生物化學(xué)途徑，參與細(xì)胞凋亡，因而認(rèn)為Caspase 激活與細(xì)胞凋亡存在密切關(guān)聯(lián)性，Caspase通過有序、多步水解過程活化，在這一過程中，目前已發(fā)現(xiàn)Caspase-3、Caspase-7 等均執(zhí)行了細(xì)胞凋亡任 務(wù)［8-9］。細(xì)胞凋亡過程為多種基因控制，比如Caspase家族、抑癌基因等，因而細(xì)胞凋亡是多種過程導(dǎo)致的，故而癌癥可能與多種疾病產(chǎn)生直接、間接關(guān)聯(lián)，諸如：癌癥、免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌疾病等［10-11］。水飛薊素對人胃癌SGC 7901 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲有抑制作用［12-15］，因而本研究通過水飛薊素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡情況，觀察子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞變化，結(jié)果提示：水飛薊素可誘導(dǎo)人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞凋亡，且使用水飛薊素作用于人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞48 h 后，細(xì)胞內(nèi)Caspase-3 表達(dá)水平明顯高于對照組，可見水飛薊素不但可誘導(dǎo)人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞凋亡，且細(xì)胞凋亡率較高，Caspase-3 表達(dá)水平升高。鑒于此，筆者推測可通過上調(diào)子宮內(nèi)膜癌患者體內(nèi)Caspase-3 表達(dá)水平，調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生過程中，水飛薊素可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，機(jī)制可能是通過上調(diào)患者體內(nèi)Caspase-3 表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)。但其發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展過程的具體作用方式有待更多研究，以幫助減輕由氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)等因素給疾病進(jìn)展帶來的不良后果，同時(shí)為子宮內(nèi)膜癌的臨床治療提供更多的基礎(chǔ)研究。