薛 珊，邢 穎*，宋華偉

0 引言

胃癌是常見的惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和死亡率[1]。胃癌早期診斷率較低，多數(shù)患者在確診時(shí)已屬于晚期，錯(cuò)過(guò)手術(shù)治療的最佳時(shí)期[2]?；熓峭砥谖赴┲委煹闹饕椒ǎ[瘤細(xì)胞常對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致化療療效降低甚至治療失敗[3]。順鉑(Cisplatin，DDP)是常用的化療藥物，尋找增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)DDP敏感性的方法對(duì)于改善晚期胃癌患者化療療效具有積極意義。芬戈莫德(Fingolimod，F(xiàn)TY720)是一種從冬蟲夏草中分離得到的鞘氨醇1-磷酸鹽受體抑制劑，可促進(jìn)淋巴細(xì)胞歸巢、誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡及抑制T淋巴細(xì)胞活性[4]。近年來(lái)研究顯示，F(xiàn)TY720還可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)化療敏感性及抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，具有一定的抗腫瘤作用[5-6]。目前，還未見FTY720對(duì)胃癌耐藥細(xì)胞影響的相關(guān)報(bào)道。本研究主要觀察了FTY720聯(lián)合DDP對(duì)DDP耐藥胃癌細(xì)胞HGC27/DDP增殖和凋亡的影響及其可能的作用機(jī)制，以期為提高晚期胃癌化療療效提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)試劑 胃癌細(xì)胞系HGC27，上海美軒生物科技有限公司;注射用DDP，山東齊魯制藥公司;胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco公司;FTY720和四甲基噻唑藍(lán)(MTT)，美國(guó)Sigma公司;LipofectamineTM2000試劑盒和Trizol試劑，美國(guó)Invitrogen公司;PCR引物、COL11A1的小干擾RNA(si-COL11A1)及亂序無(wú)意義陰性序列(si-NC)、COL11A1過(guò)表達(dá)載體(pcDNA-COL11A1)及空載體(pcDNA)，上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒和Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒，上海碧云天公司;XI型膠原α1鏈(COL11A1)單克隆抗體，武漢云克隆科技股份有限公司;細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)和活化的半胱天冬酶-3(Cleaved-caspase-3)單克隆抗體，武漢博士德公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒，大連寶生物工程有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HGC27/DDP細(xì)胞建立和轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇HGC27細(xì)胞，加入含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至80%左右時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。用含0.1 μg/ml DDP完全培養(yǎng)基作用于HGC27細(xì)胞，連續(xù)作用2周后，間歇增加5 μg/ml DDP至DDP濃度為10 μg/ml。誘導(dǎo)后，HGC27細(xì)胞能夠在含10 μg/ml DDP的培養(yǎng)基中存活，即獲得耐DDP的HGC27細(xì)胞HGC27/DDP。將對(duì)數(shù)增殖期的HGC27/DDP細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6孔板中，采用LipofectamineTM2 000脂質(zhì)體法，分別轉(zhuǎn)染si-COL11A1、si-NC、pcDNA-COL11A1、pcDNA。轉(zhuǎn)染24 h后，更換培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞備用。

1.2.2 細(xì)胞分組處理 HGC27/DDP細(xì)胞分為對(duì)照組(NC組)、DDP組、FTY720組、FTY720+DDP組。NC組：完全培養(yǎng)基干預(yù);DDP組：含10 μg/ml[7]DDP的完全培養(yǎng)基干預(yù);FTY720組：含10 μmol/L[7]FTY720的完全培養(yǎng)基干預(yù);FTY720+DDP組：含10 μg/ml DDP和10 μmol/L FTY720的完全培養(yǎng)基共同干預(yù)。轉(zhuǎn)染si-NC、si-COL11A1的細(xì)胞均用完全培養(yǎng)基干預(yù)，分別記為si-NC組和si-COL11A1組。轉(zhuǎn)染pcDNA-NC、pcDNA-COL11A1的細(xì)胞均用含10 μg/ml DDP和10 μmol/L FTY720的完全培養(yǎng)基共同干預(yù)，記為pcDNA-NC+FTY720+DDP組和pcDNA-COL11A1+ FTY720+DDP組。

1.2.3 MTT檢測(cè)HGC27/DDP細(xì)胞增殖 細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種于96孔板中，按“1.2.2”分組處理，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，加20 μl的MTT(5 mg/ml)。孵育4 h后，吸棄培養(yǎng)基，加150 μl二甲基亞砜，振蕩混勻，酶標(biāo)儀490 nm測(cè)吸光度值(A)。細(xì)胞存活率(%)=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè) HGC27/DDP細(xì)胞以2.5×104個(gè)/孔接種于24孔板中，按“1.2.2”分組處理，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞。取1.0×106個(gè)細(xì)胞，并用適量磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次。1 500 r/min離心5 min，棄上清。加400 μl結(jié)合緩沖液，混懸細(xì)胞。加10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，室溫避光孵育15 min。再加100 μl結(jié)合緩沖液，混勻后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.5 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中CyclinD1、Cleaved-caspase-3和COL11A1蛋白表達(dá) 細(xì)胞接種和分組處理時(shí)間同“1.2.4”。RIPA裂解液提取各組細(xì)胞中總蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度后定量，行SDS-PAGE電泳，并濕轉(zhuǎn)至聚PVDF膜，且于5%脫脂奶粉中封閉1 h。然后分別加CyclinD1(1∶800)、Cleaved-caspase-3(1∶1 000)和COL11A1(1∶500)一體，4 ℃孵育過(guò)夜。再加山羊抗兔二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h。最后加化學(xué)發(fā)光試劑，避光顯影，曝光拍照。以β-actin為內(nèi)參，Image J軟件分析目的蛋白條帶灰度值。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)COL11A1 mRNA表達(dá) 細(xì)胞接種和分組處理時(shí)間同“1.2.4”。Trizol試劑提取各組細(xì)胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)。COL11A1上游5′-GTCGGCAAGTCGA-TGCTCG-3′，下游5′-GCTCGAAAGCTCGCAACGTGCT-3′;β-actin上游5′-GTGCAAGCTGTGCCGCACG-3′，下游5′-CGCAACGTGCGTACAACAGT-3′。2-△△Ct法計(jì)算COL11A1 mRNA相對(duì)于β-actin的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 FTY720聯(lián)合順鉑對(duì)HGC27/DDP細(xì)胞增殖的影響 與NC組比較，F(xiàn)TY720組和FTY720+DDP組HGC27/DDP細(xì)胞存活率和CyclinD1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，DDP組HGC27/DDP細(xì)胞存活率和CyclinD1蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與DDP組或FTY720組比較，F(xiàn)TY720+DDP組HGC27/DDP細(xì)胞存活率和CyclinD1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。見圖1、表1和表2。

圖1 Western blot檢測(cè)CyclinD1蛋白表達(dá)

表1 FTY720聯(lián)合順鉑對(duì)HGC27/DDP細(xì)胞 增殖的影響(n=9)

表2 FTY720聯(lián)合順鉑對(duì)HGC27/DDP細(xì)胞CyclinD1 蛋白表達(dá)的影響(n=9)

2.2 FTY720聯(lián)合順鉑對(duì)HGC27/DDP細(xì)胞凋亡的影響 與NC組比較，F(xiàn)TY720組和FTY720+DDP組HGC27/DDP細(xì)胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，DDP組HGC27/DDP細(xì)胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與DDP組或FTY720組比較，F(xiàn)TY720+DDP組HGC27/DDP細(xì)胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。見圖2、表3。

圖2 FTY720聯(lián)合順鉑對(duì)HGC27/DDP細(xì)胞凋亡的影響注：A.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，B.Western blot檢測(cè)Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)

表3 FTY720聯(lián)合順鉑對(duì)HGC27/DDP細(xì)胞 凋亡的影響(n=9)

2.3 FTY720聯(lián)合順鉑對(duì)HGC27/DDP細(xì)胞COL11A1基因表達(dá)的影響 與NC組比較，F(xiàn)TY720組和FTY720+DDP組HGC27/DDP細(xì)胞中COL11A1 的mRNA和蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，DDP組HGC27/DDP細(xì)胞中COL11A1 的mRNA和蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與DDP組或FTY720組比較，F(xiàn)TY720+DDP組HGC27/DDP細(xì)胞中COL11A1 的mRNA和蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。見圖3、表4。

圖3 Western blot檢測(cè)COL11A1蛋白表達(dá)

表4 FTY720聯(lián)合順鉑對(duì)HGC27/DDP細(xì)胞 COL11A1基因表達(dá)的影響(n=9)

2.4 COL11A1低表達(dá)對(duì)HGC27/DDP細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與si-NC組比較，si-COL11A1組HGC27/DDP細(xì)胞存活率、COL11A1和CyclinD1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。見圖4、表5。

圖4 Western blot檢測(cè)COL11A1、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)

表5 COL11A1低表達(dá)對(duì)HGC27/DDP細(xì)胞增殖和凋亡的影響(n=9)

2.5 COL11A1高表達(dá)逆轉(zhuǎn)FTY720聯(lián)合順鉑對(duì)HGC27/DDP細(xì)胞的抗腫瘤作用 與pcDNA-NC+FTY720+DDP組比較，pcDNA-COL11A1+FTY720+DDP組HGC27/DDP細(xì)胞存活率、COL11A1和CyclinD1蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。見圖5、表6。

3 討論

腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性是腫瘤化療失敗的主要原因[8]，降低腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性對(duì)于提高腫瘤化療療效和改善患者預(yù)后具有重要意義。FTY720是一種新型免疫抑制藥物，可與西羅莫司、環(huán)孢素等聯(lián)合應(yīng)用增強(qiáng)免疫抑制作用，且能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[9-10]。有報(bào)道，F(xiàn)TY720可有效增強(qiáng)吉西他濱對(duì)人肺癌細(xì)胞株增殖的抑制作用及凋亡促進(jìn)作用，為非小細(xì)胞肺癌的治療提供了新方法[11-12]。FTY720通過(guò)下調(diào)趨化因子受體CCR4表達(dá)降低調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的遷移能力來(lái)抑制小鼠結(jié)腸癌的發(fā)展[13]。FTY720可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，為乳腺癌的治療提供了新思路[14]。目前，F(xiàn)TY720對(duì)胃癌耐藥細(xì)胞增殖、凋亡等惡性生物學(xué)行為的影響還未知。

圖5 Western blot檢測(cè)COL11A1、CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)

表6 COL11A1高表達(dá)逆轉(zhuǎn)FTY720聯(lián)合順鉑對(duì)HGC27/DDP細(xì)胞的抗腫瘤作用(n=9)

細(xì)胞的異常增殖可誘發(fā)腫瘤。CyclinD1是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，可促進(jìn)細(xì)胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)變，加速細(xì)胞增殖[15]。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是腫瘤治療的一種途徑。caspase-3是caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)關(guān)鍵調(diào)控蛋白，活化后可放大caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[16]。本研究顯示，F(xiàn)TY720作用耐順鉑胃癌細(xì)胞HGC27/DDP后，細(xì)胞存活率和CyclinD1蛋白表達(dá)降低，凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)升高，提示FTY720可能通過(guò)抑制CyclinD1表達(dá)降低HGC27/DDP細(xì)胞增殖，促進(jìn)Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示FTY720可改善胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。FTY720與順鉑共同作用HGC27/DDP細(xì)胞后，細(xì)胞存活率、凋亡率及CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)的變化更加明顯，提示FTY720可增強(qiáng)順鉑對(duì)胃癌耐藥細(xì)胞增殖抑制劑的凋亡促進(jìn)作用。

COL11A1是纖維膠原蛋白家族的重要成員之一，在前列腺癌[17]、喉鱗狀細(xì)胞癌[18]等多種腫瘤中表達(dá)異常，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展。研究顯示，干擾COL11A1表達(dá)可降低卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞的遷移、侵襲和克隆形成能力，降低卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞的耐藥性[19]。Li等[20]研究顯示，COL11A1在胃癌中發(fā)揮致癌基因作用，其表達(dá)升高促進(jìn)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲，是胃癌治療的潛在靶標(biāo)。然而，目前尚不清楚COL11A1對(duì)胃癌細(xì)胞耐藥性的影響還未知。本研究顯示，抑制COL11A1表達(dá)可降低耐順鉑胃癌細(xì)胞HGC27/DDP的增殖能力并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示COL11A1可能是改善胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥性的作用靶點(diǎn)。FTY720可抑制耐順鉑胃癌細(xì)胞HGC27/DDP中COL11A1的mRNA和蛋白表達(dá)，而FTY720聯(lián)合DDP對(duì)HGC27/DDP細(xì)胞中COL11A1的mRNA和蛋白表達(dá)的抑制作用更加明顯，提示FTY720聯(lián)合DDP可能通過(guò)抑制細(xì)胞中COL11A1表達(dá)增強(qiáng)胃癌耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。本研究還顯示，COL11A1過(guò)表達(dá)降低了FTY720聯(lián)合DDP對(duì)HGC27/DDP細(xì)胞增殖的抑制作用以及凋亡的促進(jìn)作用，進(jìn)一步說(shuō)明了FTY720聯(lián)合DDP通過(guò)下調(diào)COL11A1表達(dá)降低胃癌耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。

綜上所述，F(xiàn)TY720聯(lián)合DDP可抑制胃癌耐順鉑細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其可能通過(guò)下調(diào)COL11A1表達(dá)降低胃癌耐順鉑細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性，為通過(guò)逆轉(zhuǎn)胃癌順鉑耐藥細(xì)胞的耐藥性來(lái)改善胃癌化療療效提供了新思路。