劉德軍，賀 玲，樊苗苗，陶弘武，慕揚娜

0 引言

前列平膠囊主要由北敗醬、紅花、丹參、赤芍、桃仁、澤蘭、石韋、乳香和沒藥9味中藥組方而成，臨床上主要用于濕熱瘀阻所致的急、慢性前列腺炎的治療[1-4]。前列平膠囊方中北敗醬清熱解毒、祛瘀止痛，為君藥;紅花、桃仁活血祛瘀、潤腸止痛，赤芍清熱涼血，為其臣藥;丹參活血祛瘀、涼血消癰，乳香、沒藥散瘀定痛、消腫生肌，澤蘭祛瘀消癰、利水消腫，合為佐藥;石韋利尿通淋、涼血止血，引諸藥直達病所，為使藥，諸藥合奏，以達清熱利濕、化瘀止痛的臨床功效。前列平膠囊現(xiàn)行質量標準和文獻報道[5]中僅對芍藥苷、丹酚酸B進行了定量研究,未對方中君藥北敗醬及其他藥味所含成分進行研究。中藥及其制劑具有多組分、多靶點、整體協(xié)同作用的特點，近年來，多指標成分質量評價模式已廣泛應用于其質量控制中。本研究按照中藥質量標志物確認原則，采用HPLC-QAMS法對前列平膠囊方中君藥北敗醬所含代表性成分菊苣酸，臣藥紅花所含特征成分羥基紅花黃色素A和紅花黃色素A，佐藥丹參所含主要活性成分丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA含量進行同時測定，為全面評價前列平膠囊質量提供科學依據。

1 材料

Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)、Shimadzu LC-20A型高效液相色譜儀(日本島津公司);Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Phenomenex C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);XS105DU型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司);KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。菊苣酸對照品(批號：111752-201703，CAS號：6537-80-0，含量：97.6%)、羥基紅花黃色素A對照品(批號：111637-201810，CAS號：78281-02-4，含量：93.1%)、丹酚酸B對照品(批號：111562-201917，CAS號：121521-90-2，含量：96.6%)、丹參素鈉對照品(批號：110855-201915，CAS號：67920-52-9，含量：97.8%)和丹參酮ⅡA對照品(批號：110766-201721，CAS號：568-72-9，含量：99.5%)均來源于中國食品藥品檢定研究院;丹參酮Ⅰ對照品(批號：17051706，CAS號：568-73-0，含量：99.9%)來源于上海同田生物技術股份有限公司;紅花黃色素A對照品(批號：CFS201801，CAS號：85532-77-0，含量：98.5%)來源于武漢天植生物技術有限公司;乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純;前列平膠囊[規(guī)格：每粒裝0.42 g(相當于飲片2.2 g)，批號：20190207、20190402、20190403]來源于西安千禾藥業(yè)有限責任公司。

2 方法與結果

2.1 單組分對照品儲備液和混合對照品溶液的制備 精密稱取菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素鈉、丹酚酸B、丹參酮 Ⅰ 和丹參酮 Ⅱ A對照品各適量，用70%甲醇溶液分別制成菊苣酸0.132 mg/ml、羥基紅花黃色素A 0.918 mg/ml、紅花黃色素A 0.774 mg/ml、丹參素0.162 mg/ml、丹酚酸B 2.526 mg/ml、丹參酮Ⅰ 0.218 mg/ml、丹參酮Ⅱ A 0.356 mg/ml的單組分對照品儲備液;精密吸取單組分對照品儲備液各2.5 ml，用70%甲醇溶液定容至50 ml，制成各成分質量濃度分別為6.6、45.9、38.7、8.1、126.3、10.9和17.8 μg/ml的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液和陰性樣品溶液的制備 取前列平膠囊10粒內容物，研細混勻，精密稱取0.5 g，置25 ml量瓶中，加70%甲醇20 ml，超聲處理30 min，放冷后用70%甲醇定容至刻度，過濾制得前列平膠囊供試品溶液。按前列平膠囊質量標準WS-10459(ZD-0459)-2012Z-2018項下的工藝處方，分別制備不含北敗醬、紅花和丹參的3個陰性樣品，再按上述方法制成陰性樣品溶液。

2.3 色譜條件及專屬性試驗 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫為30 ℃;流動相：乙腈(A)-0.4%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～11.0 min，14.0%A;11.0～15.0 min，14.0%A→22.0%A;15.0～24.0 min，22.0%A→30.0%A;24.0～45.0 min，30.0%A→72.0%A;45.0～50.0 min，72.0%A→14.0%A)，流速為1.0 ml/min;檢測波長分別為330 nm(0～15.0 min檢測菊苣酸)[6]、403 nm(15.0～24.0 min檢測羥基紅花黃色素A和紅花黃色素A)[7]和280 nm(24.0～50.0 min檢測丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA)[8-10];進樣量：10 μl。精密吸取“2.1～2.2”項下各溶液依法進樣檢測，結果主成分菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素鈉、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA色譜峰峰形對稱，理論塔板數(shù)按各成分色譜峰計均不低于4 000，主成分峰與相鄰色譜峰均能有效分離，分離度均>1.5，陰性樣品對前列平膠囊中7種成分的測定無干擾，色譜圖見圖1。

圖1 專屬性試驗HPLC圖注：a.混合對照品，b.前列平膠囊，c.北敗醬陰性樣品，d.紅花陰性樣品，e.丹參陰性樣品。1.菊苣酸，2.羥基紅花黃色素A， 3.紅花黃色素A，4.丹參素，5.丹酚酸B，6.丹參酮 Ⅰ，7.丹參酮 ⅡA

2.4 線性關系考察 分別精密吸取“2.1”項下單組分對照品儲備液各0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml，置20 ml量瓶中，用70%甲醇溶液制成系列混合對照品溶液，依法進樣測定菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ和丹參酮 ⅡA的峰面積，以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，結果見表1。

表1 7個成分線性關系和范圍

2.5 進樣精密度、重復性及穩(wěn)定性考察 取“2.1”項下混合對照品溶液重復進樣6次，測得菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA色譜峰峰面積的RSD分別為1.35%、0.89%、1.01%、1.26%、0.58%、1.11%和0.97%。

取同一批號前列平膠囊樣品，按“2.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，依法進樣測定菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的峰面積，計算得7種成分含量的RSD分別為0.81%、1.34%、1.40%、1.72%、0.96%、1.58%和1.63%。

取前列平膠囊同一份供試品溶液，于制備后0、2、4、6、12、18 h、24 h進樣檢測菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的峰面積，結果前列平膠囊供試品溶液24 h內穩(wěn)定，7種成分峰面積的RSD分別為1.33%、0.91%、0.99%、1.25%、0.57%、1.08%和0.95%。

2.6 加樣回收率試驗 取已知含量的同一批次前列平膠囊內容物，研細混勻，取9份，每份0.25 g，精密稱定，置25 ml量瓶中，按《中國藥典》2015年版四部要求，分別按已知含有量的50%、100%、150% 3個水平精密加入加標對照品溶液(菊苣酸0.074 mg/ml、羥基紅花黃色素A 0.626 mg/ml、紅花黃色素A 0.422 mg/ml、丹參素0.114 mg/ml、丹酚酸B 1.818 mg/ml、丹參酮Ⅰ 0.146 mg/ml、丹參酮ⅡA 0.238 mg/ml)0.5、1.0、1.5 ml各3份，再按“2.2”項下方法制備加樣品溶液。

在上述色譜條件下進行檢測，結果所測成分菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的平均加樣回收率及RSD分別為97.86%(1.44%)、99.42%(0.96%)、99.18%(0.83%)、96.97%(1.11%)、100.02%(0.59%)、97.91%(1.37%)和98.90%(0.76%)。

2.7 相對校正因子的測定及耐用性考察

2.7.1 相對校正因子的測定 精密吸取“2.4”項下6個混合對照品溶液，依法進樣檢測菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的峰面積，以丹酚酸B為內參物，按照相對校正因子計算公式：fk/s=fk/fs=(Xk×Ys)/(Xs×Yk)(式中X代表質量濃度，Y代表峰面積，k代表內參物，s代表其他成分)計算菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的相對校正因子，結果見表2。

表2 各成分的相對校正因子

2.7.2 不同儀器、不同色譜柱對相對校正因子的影響 精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液，依法進樣檢測菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的峰面積，考察Shimadzu LC-20A型、Agilent 1200型高效液相色譜儀和Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Phenomenex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱對相對校正因子的影響，結果見表3。

表3 不同儀器、不同色譜柱對相對校正因子的影響

2.7.3 不同柱溫對相對校正因子的影響 精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液，依法進樣檢測菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的峰面積，考察不同柱溫28 ℃、29 ℃、30 ℃、31 ℃、32 ℃對相對校正因子的影響，結果見表4。

表4 不同柱溫對相對校正因子的影響

2.7.4 不同體積流量對相對校正因子的影響 精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液，依法進樣檢測菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的峰面積，考察不同流速(0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 ml/min)對相對校正因子的影響，結果見表5。

表5 不同體積流量對相對校正因子的影響

2.8 待測組分色譜峰的定位 精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液，依法進樣檢測，記錄菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的保留時間，采用相對保留時間值法對待測成分色譜峰進行定位，考察Shimadzu LC-20A型、Agilent 1200型高效液相色譜儀和Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Phenomenex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱對相對保留時間值的影響，結果見表6。

表6 不同儀器和不同色譜柱待測成分色譜峰的相對保留值

2.9 一測多評法與外標法測定結果比較 取3個批次的前列平膠囊樣品，每個批次平行制備3份前列平膠囊供試品溶液，依法進樣測定菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的峰面積，首先采用外標法(ESM)計算7種成分的含量，再以丹酚酸B為內參物，按照“2.7.1”項下相對校正因子計算菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的含量，結果見表7。結果顯示一測多評法計算值與外標法實測值無明顯差異(RAD<2.0%)，表明所建立的相對校正因子可信度較高，所建立的一測多評法可用于前列平膠囊中菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA含量的同時測定。

表7 各成分含量測定結果(mg/g)

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的確定 萃取溶劑的選擇，首先采用甲醇[11]、70%甲醇[10-11]、70%乙醇[12]、95%乙醇處理樣品，以前列平膠囊中菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的提取效果為首選指標，同時兼顧雜質峰影響等因素，結果70%甲醇處理樣品時，待測成分綜合提取率最佳，雜質峰干擾較小;提取方式的選擇，對超聲提取[6-7,9-10]和回流提取2種提取方式進行對比，結果超聲提取、回流提取所得結果差異不大，考慮到樣品處理的便捷性，選用超聲提取處理樣品;提取時間的選擇，經試驗，確定超聲提取30 min效果最佳。

3.2 色譜條件流動相的選擇 對甲醇-水[6,11-12]和乙腈-水[7-9]流動相系統(tǒng)進行考察，結果發(fā)現(xiàn),甲醇-水流動相體系檢測時，基線漂移嚴重，同時檢測時間過長;乙腈-水流動相體系檢測基線平穩(wěn)，檢測用時理想，不足之處是丹酚酸B因含量高，色譜峰出現(xiàn)平頭峰和拖尾現(xiàn)象，峰形對稱度不符合要求，考慮加入酸類調節(jié)。經試驗，最終確定采用乙腈-0.4%磷酸水溶液[7,9-10]為流動相進行梯度洗脫，前列平膠囊中待測7種成分的色譜峰峰形對稱，與相鄰色譜峰均能有效分離。

本文首次采用HPLC-QAMS法對前列平膠囊中菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA 7種成分的含量進行了同時測定，建立了前列平膠囊多指標成分同時定量的方法，所建立的方法操作便捷，結果準確可靠，對前列平膠囊質量標準提升和全面評價其產品質量，指導藥品生產企業(yè)優(yōu)化生產工藝過程控制參數(shù)，完善原藥材內控標準，確保產品質量的穩(wěn)定性提供了參考依據。采用高效液相色譜指紋圖譜結合多成分質量控制對前列平膠囊進行更加全面的質量評價還在進一步的研究中。