安海文，李 李，李燕林，劉琳娜，黃 琳，李錦山，楊文欽

0 引言

急性腎損傷或衰竭的發(fā)生多由于腎缺血再灌注損傷(Renal ischemia-reperfusion injury,RIRI)引起，此外，腎移植期間或腹主動(dòng)脈手術(shù)而導(dǎo)致的RIRI亦是多器官衰竭的誘發(fā)因素。RIRI的特征是急性腎功能惡化和腎臟炎癥，最終導(dǎo)致組織損傷[1]。RIRI的病理生理學(xué)很復(fù)雜，其特征在于3個(gè)組成部分：中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，活性氧形成和先天免疫激活，其中關(guān)于RIRI中的先天免疫激活，已經(jīng)確定了補(bǔ)體激活的關(guān)鍵作用，盡管補(bǔ)體抑制被認(rèn)為是潛在的治療策略，然而目前仍然沒(méi)有確切的用于RIRI的療法[2]。目前普遍認(rèn)可的RIRI防治原則是調(diào)控炎癥因子，減少細(xì)胞的凋亡，使缺血組織的代謝及損傷得到改善，防止鈣超載，調(diào)控再灌注條件，使自由基得到清除[3-4]，因此，相關(guān)的研究多從上述方面入手。

尿毒康合劑是我院自主研發(fā)的制劑，主要成分為黃芪、紅花、丹參、澤瀉、大黃等中藥，具有清熱解毒、益氣生血、化瘀等功效。為我院治療慢性腎功能衰竭的常用制劑，長(zhǎng)期臨床研究表明，尿毒康合劑可改善腹膜透析患者的殘余腎功能，亦能提高腹膜透析患者的透析效能，延緩腎功能惡化，具有抑制腹膜纖維化和腎臟微炎癥的作用[5-7]。目前隨訪的服用尿毒康合劑的患者中未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的嚴(yán)重副作用。此外，前期研究發(fā)現(xiàn)，尿毒康合劑可能通過(guò)降低TGF-β1蛋白的表達(dá)和減輕相應(yīng)的氧化應(yīng)激作用，防止腹膜致密層變厚及其相應(yīng)間皮細(xì)胞發(fā)生損傷[8];此外，該制劑亦可使慢性腎功能衰竭大鼠BUN、Scr水平得到控制，減輕靶器官的損傷，提高排毒能力及免疫力[9-10]。銀杏葉提取物藥理作用主要有抗氧化及血小板聚集、清除自由基、改善血液流變學(xué)等，亦可保護(hù)再灌注后的器官組織[11]。參考相關(guān)研究報(bào)道[12]，本課題組經(jīng)由外科手術(shù)建立SD大鼠RIRI的模型，以銀杏葉提取物作為陽(yáng)性藥，考察尿毒康合劑對(duì)改善腎功能的作用及其機(jī)制，以期為藥物的合理使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 73只SPF級(jí)的體重210～230 g(7～9周齡)的雄性健康的SD大鼠，購(gòu)于山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(魯)20140007，SD大鼠于中山市中醫(yī)院藥理室SPF動(dòng)物房飼養(yǎng)[使用許可證號(hào)SYXK(粵)2015-0109]，SD大鼠飼料與墊料均購(gòu)自廣州市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[飼養(yǎng)條件：控制適宜的溫濕度，溫度控制在(23±3)℃，濕度控制在(55%±15%)，每12 h進(jìn)行明暗交替]，提供適量清潔的飲用水和飼料，先進(jìn)行3 d適應(yīng)性的飼養(yǎng)，然后開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥品與試劑 尿毒康合劑(中山市中醫(yī)院制劑室研制，批號(hào)：20180102，規(guī)格：100 ml/瓶);銀杏葉提取物(江蘇金納多生物科技有限公司，批號(hào)：20171213);大鼠IL-6、IFN-γ、TNF-α ELISA試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司，批號(hào)：190238672、H3567914、S51384664，規(guī)格：96T);水合氯醛(西隴科學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20180465，AR);FAS/FASL單克隆抗體(一抗)(ThermoFisher，批號(hào)：SMFIO-PC2341);甲醛(天津市大茂化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20180606，AR);二甲苯(衡陽(yáng)市凱信化工試劑有限公司，批號(hào)：20180712);DAB試劑盒(泉州市睿信生物科技有限公司，批號(hào)：PT2397);TUNEL試劑盒(上海如吉生物科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：S9876);Cocktail(Sigma，批號(hào)：P2348);磷酸酶抑制劑[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司，批號(hào)：THG382];BCA法檢測(cè)蛋白定量試劑盒(上海士鋒生物科技有限公司，批號(hào)：JKHG564);PageRuler Prestained Protein Ladder(Thermo，批號(hào)：65496);甲醇(SPECTRUM,批號(hào)：3GI21245)、30%丙烯酰胺(衡陽(yáng)市凱信化工試劑有限公司，批號(hào)：21015556);蛋白預(yù)染Marker(北京卓悅聯(lián)合生物科技有限公司，批號(hào)：KL89664);一抗稀釋液及RIPA裂解液(上海信裕生物科技有限公司，批號(hào)：GK1167);中性樹(shù)膠、30%過(guò)氧化氫、過(guò)硫酸銨、Tris Base、Skimmed milk powder、Glycine、SDS、亞硫酸鈉、β-巰基乙醇、冰乙酸、glycerin、酒精、4%多聚甲醛、硫代硫酸鈉、磷酸緩沖鹽溶液及枸櫞酸緩沖液、Tween-20(天津大茂化學(xué)試劑);BPB(博大泰克);1%伊紅染液、顯影粉、石蠟、10%正常山羊血清、蘇木素染液及其分化液。

1.1.3 儀器 PL-25G-I離心機(jī)(Anting科學(xué)儀器廠);Muitiskan MLB3酶標(biāo)儀(熱電科技有限公司);SK961洗板機(jī)(深圳市盛信康科技有限公司);Varioskan LUX全自動(dòng)生化分析儀(賽默飛世爾);XP205DR分析天平(梅特勒);OGH180-S烘箱(賽默飛世爾);MaxQ2000臺(tái)式搖床(賽默飛世爾);FR4A熒光顯微鏡(北京世紀(jì)科信科學(xué)儀器有限公司);DYCZ-40G型轉(zhuǎn)印電泳儀(上海向帆儀器有限公司);RT-I暗室燈及暗匣(天津銘齊科技有限公司)。

1.2 分組、給藥與建模 73只SD大鼠隨機(jī)分為6組：模型組、尿毒康合劑(低劑量4.95 g/kg、中劑量9.9 g/kg、高劑量19.8 g/kg)組，假手術(shù)組、100 mg/kg銀杏葉提取物組(陽(yáng)性藥組)[12]，每組12只(模型組13只)。其中尿毒康合劑中劑量治療組給藥量相當(dāng)于人臨床等效劑量。取生理鹽水配制得到高劑量(9.9 g/ml)的尿毒康合劑適量，分別再將其稀釋2倍和4倍，得到中、低劑量的尿毒康合劑。陽(yáng)性藥及各個(gè)劑量組的尿毒康合劑均給予2 ml的藥量來(lái)灌胃，其余組給予2 ml生理鹽水代替，每組都持續(xù)給藥7 d，1次/d。7 d以后，除假手術(shù)組外，另外5組大鼠均手術(shù)建立RIRI模型，各組大鼠手術(shù)前禁食12 h，飲水自由。實(shí)驗(yàn)步驟如下：取10%的水合氯醛將各組的SD大鼠通過(guò)腹腔注射進(jìn)行麻醉(3.5 ml/kg)，發(fā)揮藥效后，層層解剖，將腹腔中的腎蒂左右兩側(cè)用無(wú)損傷微型動(dòng)脈夾快速阻斷，腎臟逐漸由鮮紅轉(zhuǎn)變成暗紫色時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，45 min后將動(dòng)脈夾撤掉，腎臟的顏色又恢復(fù)正常，此時(shí)提示造模成功，最后將腹腔縫合。假手術(shù)組的大鼠除了不進(jìn)行阻斷腎蒂血流的操作外，其余手術(shù)操作同其他組的大鼠。注意保證關(guān)閉腹腔后2 h內(nèi)，大鼠能正常活動(dòng)，且術(shù)后24 h大鼠能存活，調(diào)整適宜的環(huán)境并給予食物和飲水保證其充分的休養(yǎng)[13-14]。

1.3 血液生化指標(biāo)檢測(cè)[15-16]各組大鼠建模手術(shù)后24 h進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血，用全自動(dòng)生化分析儀分析血清中尿素氮值(BUN)及肌酐值(Scr)。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素-6(IL-6)及干擾素-γ(IFN-γ)3個(gè)炎癥指標(biāo)。

1.4 石蠟切片處理[17-19]采血后取出大鼠的2個(gè)腎臟，其中1個(gè)用4%多聚甲醛對(duì)其部分組織進(jìn)行固定，再用不同比例的乙醇、純化水及磷酸鹽緩沖溶液沖洗，最后用石蠟將切取的約0.2 cm厚的組織包埋，二甲苯脫蠟后沖洗，再用枸櫞酸buffer(pH值為0)煮沸，放冷后沖洗干凈。

1.5 腎小管上皮細(xì)胞凋亡率的檢測(cè) 按照TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法處理上述石蠟切片，再用熒光顯微鏡(400×)觀察拍照，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)未凋亡的細(xì)胞發(fā)出藍(lán)色熒光，凋亡的細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，隨機(jī)分析計(jì)算腎小管上皮細(xì)胞凋亡率(細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)÷總細(xì)胞數(shù)×100%)[20-21]。

1.6 腎組織FAS、FASL蛋白的表達(dá)檢測(cè) 將以上石蠟切片用10%正常山羊血清封閉30 min，在4 ℃條件下，一抗孵育12 h，用buffer沖洗后將二抗及鏈霉素卵白素工作液依次加入，轉(zhuǎn)至37 ℃環(huán)境繼續(xù)孵育30 min，用buffer沖洗后經(jīng)過(guò)DAB/H2O2反應(yīng)，最后用蘇木素染色再脫水封片。用顯微鏡觀察記錄上述處理的切片，分析計(jì)算放大200倍與400倍時(shí)的積分光密度值(IOD/area)并繪制統(tǒng)計(jì)圖比較分析[17-19]。

1.7 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)檢測(cè)(Western blot法) 將上述取出的另一個(gè)腎臟的部分組織置于冰上，加適量蛋白質(zhì)裂解液反應(yīng)30 min，再低溫離心5 min(13 500 r/min)，分離出上清液，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)采用BCA方法進(jìn)行定量分析。通過(guò)SDS-PAGE電泳對(duì)上述分離得到的蛋白進(jìn)行分析，再將轉(zhuǎn)模后得到的雜交膜用TBST沖洗，并于室溫下用5%脫脂奶粉溶液封閉1 h。最后一抗孵育過(guò)夜并漂洗后，在37 ℃條件下用二抗孵育1 h，TBST漂洗2遍即得雜交膜，將帶有熒光的化學(xué)底物添加其中于暗盒中顯影。以GAPDH為內(nèi)參，考察目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)[14,22]。

2 結(jié)果

2.1 血液生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 由表1及表2可知，與假手術(shù)組大鼠對(duì)比，模型組大鼠血清中的Scr、BUN、IL-6、TNF-α及IFN-γ水平明顯上升，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組大鼠比，尿毒康合劑低、中、高劑量組及銀杏提取物組大鼠血清中的上述各指標(biāo)均有下降趨勢(shì)，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外，從相對(duì)模型組的下降程度來(lái)看，尿毒康合劑高劑量組的幾個(gè)指標(biāo)相對(duì)模型組下降幅度均較中、低劑量組大，部分指標(biāo)下降幅度甚至超過(guò)陽(yáng)性藥。

表1 各組大鼠血清中Scr、BUN水平比較

2.2 腎小管上皮細(xì)胞凋亡率對(duì)比 用TUNEL法檢測(cè)的結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，模型組大鼠與假手術(shù)組大鼠相比，腎小管上皮細(xì)胞凋亡率明顯上升(P<0.01)，此外，尿毒康合劑低、中、高劑量組大鼠與模型組大鼠相比細(xì)胞凋亡率均有所下降，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)型趨勢(shì)，隨著尿毒康合劑劑量的提高凋亡率也隨著下降，尿毒康合劑高劑量組抑制細(xì)胞凋亡的效果優(yōu)于陽(yáng)性藥組。見(jiàn)圖1、表3。

表2 各組大鼠血清中IL-6、TNF-α、IFN-γ水平比較

圖1 各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡結(jié)果比較(400×)

表3 各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡率比較

2.3 各組大鼠FAS、FASL蛋白表達(dá)水平比較 圖2為各組大鼠腎組織石蠟切片在放大200倍與400倍視野下測(cè)得的FAS和FASL蛋白表達(dá)量。模型組大鼠相對(duì)于假手術(shù)組兩種蛋白的表達(dá)量均明顯升高，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外，相對(duì)于模型組大鼠，隨著尿毒康合劑劑量的提高，上述蛋白表達(dá)量也相應(yīng)降低，其程度亦具有劑量依賴(lài)性，劑量越大降低的趨勢(shì)就越明顯。

2.4 Western blot法檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平 圖3、表4顯示，模型組大鼠相對(duì)于假手術(shù)組，Bcl-2和VEGF蛋白的表達(dá)量較低，其余腎小管上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)均較高，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而尿毒康合劑各劑量組相比，模型組大鼠Bcl-2和VEGF蛋白的表達(dá)量較高，其余腎小管上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)均較低。尿毒康合劑各劑量組的大鼠7種蛋白的表達(dá)均有劑量依賴(lài)性的變化趨勢(shì)，其中Bcl-2和VEGF蛋白的表達(dá)量隨著給藥劑量的增加而增加，其余5種蛋白則反之。

圖2 各組大鼠腎組織石蠟切片在200×與400×下測(cè)得的FAS和FASL蛋白表達(dá)量比較注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01;與模型組比較，#P<0.05

表4 各組大鼠腎組織Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2、Bad和VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

圖3 各組大鼠腎組織Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2、Bad和VEGF蛋白表達(dá)電泳圖

3 討論

本課題組前期報(bào)道了尿毒康合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[23]，因此，上述研究的樣品質(zhì)量具有可重復(fù)性，從而保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性。

RIRI可致腎功能廣泛性損傷，從而致使腎小球的通透性增強(qiáng)而濾過(guò)率下降，腎小管上皮細(xì)胞受損致重吸收作用減弱，而Scr、BUN升高常預(yù)示上述病理現(xiàn)象，因此二者常作為評(píng)價(jià)腎功能的生化指標(biāo)。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，尿毒康合劑對(duì)降低Scr和BUN指標(biāo)有一定作用，故而一定程度上尿毒康合劑可改善腎功能。

炎癥過(guò)程始于腎小管上皮損傷，使得腎小管上皮細(xì)胞功能障礙及IL-6、TNF-α、IFN-γ等免疫調(diào)節(jié)因子被釋放到血液循環(huán)及腎組織中，進(jìn)而使血管黏附分子表達(dá)增加及白細(xì)胞之間黏附作用增強(qiáng)。此外，有研究表明，炎癥反應(yīng)在RIRI過(guò)程中起重要作用，而IL-6、TNF-α及IFN-γ可間接反映炎癥反應(yīng)的程度[16,24]。本研究結(jié)果表明，尿毒康合劑可能通過(guò)降低炎癥因子水平來(lái)減輕炎癥反應(yīng)對(duì)組織器官的損傷。

由各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡率比較可知，尿毒康合劑劑量越大，對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用越強(qiáng)，因此，可通過(guò)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平來(lái)評(píng)價(jià)藥效。細(xì)胞表面受體蛋白FAS通過(guò)與其配體FASL結(jié)合來(lái)激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，進(jìn)而促使細(xì)胞凋亡[25]，因此，可通過(guò)抑制FAS和FASL來(lái)抑制細(xì)胞凋亡。Bax及Bad均為常見(jiàn)的促細(xì)胞凋亡蛋白，而B(niǎo)cl-2為抑制細(xì)胞凋亡蛋白，Bax與Bcl-2二者高度相關(guān)，其比例大小可影響腎小管上皮細(xì)胞凋亡[26]。VEGF蛋白為促使內(nèi)皮細(xì)胞增殖的有絲分裂原，具有調(diào)控血管通透性及改善新生血管等作用，因此，VEGF蛋白的高表達(dá)可促進(jìn)腎功能的恢復(fù)[27]。線粒體及死亡受體兩個(gè)途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡都有Caspase 家族相關(guān)蛋白參與，其中Caspase-3為凋亡執(zhí)行因子，Caspase-8及Caspase-9均為Caspase-3執(zhí)行細(xì)胞凋亡的輔助因子，三者的綜合作用可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[28]。綜上所述，Bax、Bad、Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9這5種蛋白高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)cl-2與VEGF蛋白分別具有抑制細(xì)胞凋亡與促進(jìn)細(xì)胞增殖的功能。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，尿毒康合劑可通過(guò)降低促細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)，增加抑制細(xì)胞凋亡蛋白和促細(xì)胞增殖蛋白的表達(dá)來(lái)減輕腎小管上皮細(xì)胞凋亡所帶來(lái)的損傷。