謝圓媛，胡海峰，趙 莉，薛 鵬

0 引言

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種具有氣流阻塞特征的慢性支氣管炎和肺氣腫，威脅著公眾的健康和生活質(zhì)量[1-4]。COPD通常是由于接觸有害顆?；驓怏w引起的，吸煙是主要的危險因素之一[5-6]。慢性氣道炎癥和肺氣腫是COPD的兩種主要病理亞型，會引起免疫功能紊亂和肺組織破壞，然而，COPD的發(fā)病機(jī)制及其診斷和治療的有效生物標(biāo)記尚未闡明[7-8]。因此，探索獨立的生物標(biāo)志物并研究其致病機(jī)制有利于COPD的早期診斷和治療。

研究證實，不同炎癥因子指標(biāo)水平能準(zhǔn)確反映COPD患者的肺功能損傷程度、病情的發(fā)展程度，對疾病的診斷具有重要的指導(dǎo)意義[9]。COPD中炎癥的發(fā)生會引起肺泡組織中ECM的紊亂導(dǎo)致肺組織重塑，從而加重COPD的發(fā)生。MicroRNAs(miRNAs)是一類20-24bp的內(nèi)源性非編碼RNA，通過靶向mRNA的3′非翻譯區(qū)調(diào)節(jié)生理和病理功能。越來越多的研究表明，miRNA在COPD的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-101-3p.1可以作為診斷COPD的獨立生物標(biāo)志物，通過激活EGFR/PI3K/Akt途徑促進(jìn)COPD的發(fā)生[10]。COPD的血漿和肺組織中miR-29b表達(dá)降低，并且與肺的功能變化顯著相關(guān)[11]。miR-145-5p作為miR-145家族的一員，已被廣泛證實與多種人類惡性腫瘤有關(guān)[12]。最近的一項研究表明，COPD患者肺組織中miR-145-5p的表達(dá)較低，miR-145-5p通過負(fù)調(diào)節(jié)KLF5抑制CSE誘導(dǎo)的HBEC凋亡和炎癥[13]。與非吸煙者相比，COPD患者氣道平滑肌細(xì)胞中miR-145的過表達(dá)可抑制促炎性細(xì)胞因子的釋放[14]。

本實驗通過研究miR-145在COPD炎癥的發(fā)生、ECM的降解以及在P13K/Akt/mTOR通路中的作用，同時分析miR-145與SMAD3的靶向關(guān)系，以期為后續(xù)研究治療COPD的方法提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司;通用反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RIPA強(qiáng)蛋白裂解液、蛋白抑制劑PMSF、總RNA提取試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司;實時熒光定量PCR染料Ultra SYBR Mixture購自康為世紀(jì)生物科技有限公司;Asvanced轉(zhuǎn)染試劑購自ZATA LIFE公司(美國);IL-10 Rabbit mAb、EMMPRIN Rabbit mAb、SMAD3 Antibody購自Cell Signaling Technology公司;Anti-IL-6/IL-8/P13K/Akt/mTOR/MMP9/β-actin antibody購自Abcam公司;Goat anti-Mouse/Rabbit IgG(H+L)-HRP購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;miR-145 inhibitor/mimics、NC mimics/inhibitor(濃度均為20 μM/μl)均送武漢金開瑞生物科技有限公司合成;pEGFP-N1-SMAD3質(zhì)粒為前期構(gòu)建，Cell Counting Kit-8、Human IL-6/8/10 ELISA Kit購自碧云天有限公司。

香煙煙霧提取物(CSE)的制備：按照Wu等[15]方法，將2支無濾嘴香煙的煙氣溶于10 ml無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(每支香煙2 min)，將pH值調(diào)節(jié)至7.4，并將獲得的100%CSE溶液通過0.22 μM的過濾器進(jìn)行滅菌并保存在-80 ℃，作為CSE的初始溶液。每次使用前制備工作濃度為20%的CSE溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 人肺樣本采集 肺切除標(biāo)本取自延安大學(xué)附屬醫(yī)院的30例行肺切除術(shù)的患者。受試者分為3組：有COPD的吸煙者(10例)、無COPD的吸煙者(10例)、無COPD的非吸煙者(10例)，獲得了其肺組織樣本，所有受試者臨床穩(wěn)定，無化療或放療，沒有患者接受任何皮質(zhì)類固醇或抗菌藥物治療，或有其他呼吸系統(tǒng)疾病史，哮喘，肺部感染的診斷，均簽署了知情同意書，并獲得本醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)和監(jiān)督。用組織基因組DNA提取試劑盒提取樣本DNA后，保存于-20 ℃，用于后期RT-PCR實驗。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人支氣管上皮細(xì)胞(HBEC)株購自中國科學(xué)院研究所，將購買的細(xì)胞從干冰中取出后，于42 ℃水中快速解凍，1 000 r/min離心3 min后用含有血清濃度為10%的1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀至90 mm培養(yǎng)皿中，在37 ℃、5%CO2的條件下于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將支氣管上皮細(xì)胞暴露于20%CSE條件下24 h以模擬COPD細(xì)胞。

1.4 ELISA實驗 將20%CSE處理過的支氣管上皮細(xì)胞按1×105個/孔接種至96孔板，待細(xì)胞密度大約70%左右時，按照Asvanced轉(zhuǎn)染試劑說明書將miR-145mimics/inhibitor(10 μM)、NC mimics/inhibitor(10 μM)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h后，收集細(xì)胞上清進(jìn)行ELISA檢測。將ELISA試劑盒從4 ℃取出后室溫放置20 min，配制濃度分別為0、18.75、37.5、75、150、300、600 pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品，分別將細(xì)胞上清和不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品按100 μl/孔加入酶標(biāo)孔中，室溫孵育2 h;每孔300 μl洗滌液洗滌5次;加入生物素化抗體100 μl/孔，室溫孵育1 h;每孔300 μl洗滌液洗滌5次;加入100 μl/孔辣根過氧化物酶，室溫避光孵育20 min后，洗滌5次;加入100 μl/孔TMB溶液，室溫避光孵育20 min;加入50 μl/孔終止液，混勻后于酶標(biāo)儀中測量OD450值。通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算細(xì)胞上清中IL-6、IL-8、IL-10的濃度。

1.5 細(xì)胞增殖實驗 將20%CSE處理過的支氣管上皮細(xì)胞按1×105個/孔接種至96孔板，待細(xì)胞密度大約70%時，將miR-145mimics/inhibitor(10 μM)、NC mimics/inhibitor(10 μM)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，在37 ℃、5%CO2的條件下于培養(yǎng)箱中孵育2 h，于酶標(biāo)儀中測量OD450值，進(jìn)行分析。

1.6 RT-PCR實驗 將20%CSE處理過的支氣管上皮細(xì)胞按1×106個/孔接種至12孔板，待細(xì)胞密度約70%左右時，將miR-145 mimics/inhibitor(100 μM)、NC mimics/inhibitor(100 μM)、pEGFP-N1-SMAD3/pEGFP-N1(5 μg)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h后，用總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞的總RNA，利用核酸濃度測定儀進(jìn)行濃度的測定后，各取2 μg用通用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)。用反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，β-actin作內(nèi)參，通過RT-PCR檢測不同樣品中SMAD3、IL-6、IL-8、IL-10、MMP-9、EMMPRIN、P13K、Akt、mTOR的含量;同時，以實驗提取的DNA為模板，U6或β-actin作內(nèi)參，檢測血液樣品中miR-145、SMAD3的含量。反應(yīng)體系包括：cDNA/DNA 1 μl，2×Ultra SYBR Mixture 10 μl，上下游引物各1 μl，dd H2O 7 μl。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 10 min;95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，采集熒光，共40個循環(huán);溶解曲線55～95 ℃，每次升高0.5 ℃。每個樣品設(shè)置3個重復(fù)，相對定量結(jié)果用2-△△CT法分析。RT-PCR定量引物見表1。

1.7 蛋白免疫印跡實驗 將20%CSE處理過的支氣管上皮細(xì)胞按1×106個/孔接種至6孔板，待細(xì)胞密度約70%時，將miR-145 mimics/inhibitor(200 μM)、NC mimics/inhibitor(200 μM)、pEGFP-N1-SMAD3/pEGFP-N1(10 μg)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h后，用含有PMSF的RIPA裂解液提取總蛋白后，使用BCA試劑盒確定濃度。通過12%SDS-PAGE電泳后，將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉后，將膜與特異性一抗(SMAD3、IL-6、IL-8、IL-10、MMP-9、EMMPRIN、P13K、Akt、mTOR)在4 ℃孵育過夜，用TBST洗滌后，將膜與二抗在室溫下孵育1 h，用TBST洗滌后，加入ECL顯色液，于凝膠成像儀中曝光拍照。

表1 RT-PCR的定量引物

1.8 熒光素酶活性分析實驗 應(yīng)用TargetScan、miRanda和PicTar數(shù)據(jù)庫分析miR-145與SMAD3的結(jié)合位點。將含有miR-145結(jié)合位點的SMAD3-3′UTR-WT和定點突變的SMAD3-3′UTR-MUT(將SMAD3-3′UTR基因片段中與miR-145相互結(jié)合的位點突變?yōu)榛パa(bǔ)序列)插入到熒光素酶報告載體pGL3中。將支氣管上皮細(xì)胞接種至12孔板中，分別將Asvanced轉(zhuǎn)染試劑(5 μl)與miR-145 mimics(100 μM)+pGL3-SMAD3-3′UTR-WT質(zhì)粒(5 μg)、NC mimics(100 μM)+pGL3-SMAD3-3′UTR-WT(5 μg)、miR-145 mimics(100 μM)+pGL3-SMAD3-3′UTR-MUT質(zhì)粒(5 μg)、NC mimics(100 μM)+pGL3-SMAD3-3′UTR-MUT(5 μg)轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后，按照熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測熒光素酶的活性。

2 結(jié)果

2.1 miR-145、SMAD3在COPD吸煙者、無COPD吸煙者、無COPD未吸煙者肺組織中的表達(dá) 為了驗證miR-145在慢性阻塞性疾病中低表達(dá)，本研究對有COPD的吸煙者、無COPD的吸煙者、無COPD的非吸煙者肺組織中miR-145、SMAD3的含量進(jìn)行了檢測。

結(jié)果顯示，有COPD的吸煙者與無COPD的非吸煙者比較，miR-145的含量降低，SMAD3的含量升高(圖1)。綜上，miR-145在COPD中低表達(dá)，SMAD3高表達(dá)，提示我們應(yīng)該更進(jìn)一步研究兩者在COPD發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

圖1 RT-PCR檢測不同樣品肺組織中miR-145、SMAD3的表達(dá)注：與無COPD的非吸煙者組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.2 miR-145抑制COPD炎癥的發(fā)生 miR-145 mimics /inhibitor轉(zhuǎn)染20%CSE處理的支氣管上皮細(xì)胞，檢測其IL-6、IL-8、IL-10的表達(dá)情況。ELISA結(jié)果顯示，miR-145 mimics組IL-6、IL-8、IL-10的含量均低于NC mimics 組(圖2A～C)。RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，miR-145 mimics組與NC mimics組比較，miR-145 mimics能夠顯著抑制IL-6、IL-8、IL-10 的表達(dá)(圖2D～G)。miR-145 inhibitor組與NC inhibitor 組比較，與以上結(jié)果完全相反(圖2A～G)。綜上，miR-145能夠抑制支氣管上皮細(xì)胞炎癥的發(fā)生，從而減緩COPD的癥狀。

2.3 miR-145促進(jìn)COPD ECM的降解 將miR-145 mimics /inhibitor轉(zhuǎn)染20%CSE處理過的支氣管上皮細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR和Western blot檢測，結(jié)果顯示，miR-145 mimics組與NC mimics組比較，miR-145 mimics能夠促進(jìn)MMP-9、EMMPRIN 的表達(dá)。miR-145 inhibitor組和NC inhibitor組比較，與以上結(jié)果完全相反。綜上，miR-145通過抑制支氣管上皮細(xì)胞炎癥的發(fā)生從而促進(jìn)ECM的降解見圖3。

2.4 miR-145通過P13K/Akt/mTOR調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖 將miR-145 mimics /inhibitor轉(zhuǎn)染20%CSE處理過的支氣管上皮細(xì)胞，首先通過CCK-8法檢測細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯示，miR-145 mimics組與NC mimics組比較，miR-145 mimics能夠抑制支氣管上皮細(xì)胞的增殖(圖4A)。RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，miR-145 mimics組與NC mimics組比較，miR-145 mimics能夠抑制P13K、Akt、mTOR的表達(dá)(圖4B～E)。miR-145 inhibitor組與NC inhibitor 組比較，與以上結(jié)果完全相反(圖4)。綜上，miR-145通過抑制P13K/Akt/mTOR通路的發(fā)生，從而抑制細(xì)胞的生長，減緩COPD疾病的發(fā)生。

2.5 熒光素酶活性分析實驗驗證miR-145靶向結(jié)合SMAD3 首先，通過TargetScan、miRanda和PicTar數(shù)據(jù)庫分析比對，結(jié)果顯示，SMAD3-3’UTR中包含了能夠與miR-145完全互補(bǔ)的一段序列(圖5A)。熒光素酶活性分析實驗結(jié)果顯示，miR-145 mimics+pGL3-SMAD3-3’UTR-WT組與NC mimics+pGL3-SMAD3-3′UTR-WT組比較，熒光素酶活性顯著降低，而突變型兩組相比熒光素酶活性沒有顯著變化(圖5B)。然后，將miR-145 mimics /inhibitor轉(zhuǎn)染支氣管上皮細(xì)胞后，RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，miR-145 mimics組與NC mimics組比較，miR-145 mimics能夠抑制SMAD3的表達(dá)(圖5C～D)，miR-145 inhibitor組與NC inhibitor 組比較，與以上結(jié)果完全相反(圖5C～D)。

圖2 miR-145對COPD炎癥的影響

ics/inhibitor對IL-6、IL-8、IL-10表達(dá)的影響。與NC mimics/inhibitor組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖3 RT-PCR、Western blot方法檢測miR-145 mimics/inhibitor對MMP-9、EMMPRIN表達(dá)的影響注：與NC mimics/inhibitor組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.6 SMAD3對COPD炎癥的發(fā)生、ECM的降解以及P13K/Akt/mTOR通路的影響 將pEGFP-N1-SMAD3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染20%CSE處理過的支氣管上皮細(xì)胞48 h后進(jìn)行RT-PCR、Western blot檢測，結(jié)果顯示，pEGFP-N1-SMAD3組與pEGFP-N1組比較，SMAD3能夠促進(jìn)IL-6、IL-8、IL-10、P13K、Akt、mTOR的表達(dá)，抑制MMP-9、EMMPRIN的表達(dá)(圖6A～B)。

3 討論

COPD是一種慢性非均質(zhì)性肺疾病，檢查方法主要通過肺功能檢查、X線拍片、CT、血氣分析等等，該病的治療方法主要包括藥物治療和康復(fù)治療，治療策略旨在改善癥狀并防止病情加重，這些方法主要基于疾病的嚴(yán)重程度和癥狀，而不是基于個體的疾病病理，都不利于患者疾病的診斷與治療[16-17]。

圖4 miR-145對COPD增殖的影響注：A.CCK-8法檢測miR-145 mimics/inhibitor對細(xì)胞增殖的影響;B～E.RT-PCR、Western blot方法檢測miR-145 mimics/inhibitor對 P13K/Akt/mTOR通路的影響。與NC mimics/inhibitor組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖5 熒光素酶活性分析實驗驗證miR-145靶向SMAD3

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在肺部疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用，對癌癥的診斷、預(yù)防以及新藥物的研發(fā)具有重要的意義[18-19]。有研究報道，miRNA-145在COPD患者的肺組織中低表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)上調(diào)miRNA-145能夠抑制肺部炎癥的發(fā)生，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[13]。因此，本研究首先通過RT-PCR檢測了有COPD的吸煙者、無COPD的吸煙者、無COPD的未吸煙者的肺組織中miRNA-145的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)COPD吸煙患者的肺組織中miRNA-145的表達(dá)量較低，驗證了以上結(jié)果。COPD的發(fā)生會導(dǎo)致肺部組織炎癥的發(fā)生，炎癥因子的持續(xù)浸潤會加重肺部組織的損傷，加速肺部纖維細(xì)胞的活化，從而抑制ECM的降解途徑，最終導(dǎo)致氣道重塑，對肺組織造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷，嚴(yán)重加劇患病程度[20-21]。

圖6 RT-PCR、Western blot檢測SMAD3對IL-6、IL-8、IL-10、MMP-9、EMMPRIN、P13K、Akt、mTOR的影響注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

SMAD3是SMAD家族中的一個蛋白，有研究表明，SMAD3在腫瘤以及癌癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，SMAD3磷酸化水平的降低，能夠抑制大鼠肺部炎癥的發(fā)生，改善肺功能;miR-140通過下調(diào)Smad3蛋白的表達(dá)抑制非小細(xì)胞肺癌的侵襲和遷移;歐前胡素通過TGF-β1/Smad3和PI3K/Akt通路抑制小鼠的哮喘;人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞通過與TGF-β/Smad和PI3K / AKT信號通路交叉相互作用，促進(jìn)乳腺癌MCF7細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化;TGF-β/Smad和PI3K/Akt/mTOR信號通路參與了肺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[22-25]。但是，在COPD中，SMAD3與P13K/Akt/mTOR通路的關(guān)系，少有文獻(xiàn)報道。在前期的實驗研究中，通過軟件分析預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miRNA-145可能靶向SMAD3基因，并且通路分析顯示，可能與P13K/Akt/mTOR通路有關(guān)。

本研究將miR-145 mimics/inhibitors轉(zhuǎn)染COPD細(xì)胞模型48 h后，發(fā)現(xiàn)miR-145通過靶向SMAD3，抑制COPD炎癥的發(fā)生，促進(jìn)ECM的降解，并且通過抑制P13K/Akt/mTOR通路的發(fā)生，抑制細(xì)胞的增殖，最終改善COPD的發(fā)展。