林 彤，李 麗，梁彩君，曾 輝，李曉良，彭立生

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 深圳518033； 2.深圳市第三人民醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 深圳 518033； 3.深圳市中醫(yī)院科教科，廣東 深圳 518033)

隨著新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)診治工作的推進(jìn)，臨床治愈的患者迅速增多，雖已滿足出院標(biāo)準(zhǔn)[1]，但部分患者仍存在乏力、納差、憋悶和干咳等癥狀，肺部CT仍顯示散發(fā)陰影，伴有不同程度的間質(zhì)性肺炎和肺功能受損，甚至有肺纖維化的可能[2]。部分高齡患者因免疫能力低下，不能排除再次感染的風(fēng)險(xiǎn)，因此，恢復(fù)期治療不容忽視。

由國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》自試行第3版起納入中醫(yī)治療[1]，各省、自治區(qū)、直轄市對(duì)該病各階段病機(jī)的認(rèn)識(shí)雖各不相同，但基本將其分為預(yù)防期，觀察期，臨床治療初、中、重癥及恢復(fù)期，恢復(fù)期以肺脾氣虛證或氣陰兩虛證為主[3]。本研究團(tuán)隊(duì)所處的廣東省結(jié)合嶺南地區(qū)氣候與地域特色，針對(duì)恢復(fù)期肺脾氣虛證，推薦參苓白術(shù)散為基礎(chǔ)方劑[4]。參苓白術(shù)散出自宋朝《太平惠民和劑局方》，是“培土生金”的代表方，方中人參、白術(shù)及茯苓健脾益肺燥濕，為君藥；山藥、蓮子、白扁豆并薏苡仁健脾滲濕止瀉，為臣藥；砂仁醒脾化濕，桔梗宣肺利氣、載藥上行，均為佐藥；炒甘草健脾和中為使，全方補(bǔ)脾益肺、滲濕止瀉，常用于肺系及脾胃系疾病。

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶Ⅱ(ACE2)是冠狀病毒的受體[5]；冠狀病毒木瓜樣蛋白酶(PLP)和3CL水解酶(Mpro)是病毒復(fù)制過(guò)程中重要的酶[6]；上述3個(gè)蛋白與病毒入侵及復(fù)制相關(guān)，被作為COVID-19藥物研發(fā)的主要靶點(diǎn)[7-8]。

中醫(yī)學(xué)的優(yōu)勢(shì)在于“系統(tǒng)調(diào)節(jié)”，但作用機(jī)制復(fù)雜，造成相關(guān)研究難度較大。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與中醫(yī)學(xué)有相似的“整體觀”，能較全面地探討藥物與疾病間的聯(lián)系。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，挖掘參苓白術(shù)散的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及潛在靶點(diǎn)，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析提取重要靶點(diǎn)，并對(duì)重要靶點(diǎn)行功能富集分析，闡釋方劑的潛在藥效機(jī)制，最后用分子對(duì)接技術(shù)探討其核心成分對(duì)于預(yù)防病毒“再感染”的可能性，綜合分析參苓白術(shù)散治療恢復(fù)期COVID-19的可行性，為其臨床應(yīng)用及科研提供參考。

1 資料與方法

1.1 參苓白術(shù)散活性成分搜集

結(jié)合中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)和中醫(yī)藥百科全書(shū)數(shù)據(jù)庫(kù)(the encyclopedia of traditional Chinese medicine，ETCM)，搜集參苓白術(shù)散所含的化學(xué)成分，依次輸入方劑所含10味中藥的名稱；以TCMSP中口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)篩選活性成分。在PubChem下載每個(gè)化合物的三維結(jié)構(gòu)文件，并記錄化合物的SMILES式。

1.2 靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

利用3個(gè)平臺(tái)進(jìn)行活性成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)。(1)Swiss Target Prediction：在該平臺(tái)分別輸入每個(gè)活性成分的SMILES式，其基于“分子相似性”預(yù)測(cè)化合物的靶點(diǎn)，保留預(yù)測(cè)結(jié)果中概率≥0.7的靶點(diǎn)；(2)PharmMapper：將化合物的三維結(jié)構(gòu)文件分別上傳至該平臺(tái)，其基于“藥效團(tuán)反向分子對(duì)接”原理預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，篩選結(jié)果中匹配度>3分者；(3)保存TCMSP提供的靶點(diǎn)。將3個(gè)來(lái)源的靶點(diǎn)合并去重，用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)將靶點(diǎn)全稱統(tǒng)一為人類基因標(biāo)準(zhǔn)名。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

采用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)Network Analyzer插件分析網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)表示中藥、活性成分或靶點(diǎn)，連接節(jié)點(diǎn)的邊表示其間關(guān)系。

1.4 靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

將“1.2”中預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)輸入STRING平臺(tái)進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)分析，物種設(shè)為“人”，最低相互作用閾值設(shè)為0.7(較高)，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape分析，憑度值提取重要靶點(diǎn)。

1.5 功能富集分析

采用Cytoscape的GlueGO插件對(duì)重要靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)生物學(xué)過(guò)程(biological process，BP)功能富集分析和基于京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)的通路富集分析，置信區(qū)間均設(shè)為P<0.01，采用R軟件ggplot2包將結(jié)果可視化。

1.6 分子對(duì)接

采用iGEMDOCK 2.1軟件進(jìn)行分子對(duì)接，選擇標(biāo)準(zhǔn)對(duì)接模式，參數(shù)設(shè)置如下：群體大小=200，子代數(shù)目=80，解的個(gè)數(shù)=2。對(duì)接結(jié)果表示為受體與配體結(jié)合的總能量，能量越低，結(jié)合程度越高，兩者發(fā)生作用的可能性越大；本研究以靶點(diǎn)蛋白與原配體的結(jié)合能量作為對(duì)照。從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載靶點(diǎn)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，ACE2、PLP和Mpro對(duì)應(yīng)的PDB編號(hào)分別為2ajf、6bi8和6lu7；從ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)下載活性成分和靶點(diǎn)原配體三維結(jié)構(gòu)的MOL2文件。

2 結(jié)果

2.1 活性成分篩選

根據(jù)篩選條件，并剔除無(wú)靶點(diǎn)的活性成分，共納入127種活性成分，人參、白術(shù)、茯苓、山藥、蓮子、白扁豆、薏苡仁、砂仁、桔梗和甘草分別貢獻(xiàn)13、4、8、11、5、1、6、8、4和72個(gè)活性成分，部分中藥間成分存在重疊。

2.2 中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中包括330個(gè)節(jié)點(diǎn)(10個(gè)中藥，127個(gè)成分，193個(gè)靶點(diǎn))和1 571條邊。在網(wǎng)絡(luò)中，1個(gè)節(jié)點(diǎn)的度值指與該節(jié)點(diǎn)連接的邊的數(shù)目，一般認(rèn)為，度值≥所有節(jié)點(diǎn)度值中位數(shù)2倍的節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中有較重要的地位。該網(wǎng)絡(luò)中，每個(gè)活性成分平均作用于11.86個(gè)靶點(diǎn)，每個(gè)靶點(diǎn)平均受7.8個(gè)活性成分調(diào)控，體現(xiàn)了中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、成分間協(xié)同作用的特點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

注：方形節(jié)點(diǎn)表示中藥；箭頭形節(jié)點(diǎn)表示活性成分；圓形節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)；度值越大的節(jié)點(diǎn)面積越大Note: square nodes represent traditional Chinese medicine; arrow-shaped nodes represent active ingredients; round nodes represent targets; the greater the degree, the greater the area of the node圖1 中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig 1 Chinese medicine-active ingredient-target network

所有活性成分度值中位數(shù)為11，度值≥22的節(jié)點(diǎn)有20個(gè)；度值排序居前5位的活性成分為C47(二氫槲皮素)、C1(山柰酚)、C48(木犀草素)、C57(7-甲氧基-2-甲基-異黃酮)和C2(豆甾醇)，對(duì)應(yīng)度值53、51、36、32和30，其與137個(gè)(>70%)靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)，故可以認(rèn)為上述5個(gè)成分是參苓白術(shù)散的核心藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。表1為度值排序居前10位的活性成分。

表1 參苓白術(shù)散的主要活性成分(前10位，度值排序)Tab 1 Main active ingredients of Shenling Baizhu powder(top 10, ranking by degree)

所有靶點(diǎn)度值中位數(shù)為2，度值≥4的節(jié)點(diǎn)有49個(gè)，說(shuō)明這49個(gè)靶點(diǎn)受到4個(gè)以上活性成分的調(diào)控，取這些靶點(diǎn)進(jìn)行PPI分析。度值排序居前5位的靶點(diǎn)為前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2(PTGS2)、雌激素受體1(ESR1)、雄激素受體(AR)、核受體輔激活因子2(NCOA2)和一氧化氮合酶(NOS2)，度值分別為94、68、65、60和59，其受到最多活性成分的調(diào)控。

2.3 靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

PPI網(wǎng)絡(luò)中有47個(gè)節(jié)點(diǎn)(2個(gè)靶點(diǎn)無(wú)相互作用信息，未在網(wǎng)絡(luò)中)和216條邊，見(jiàn)圖2。網(wǎng)絡(luò)中所有節(jié)點(diǎn)的中位數(shù)為9，>中位數(shù)的靶點(diǎn)有26個(gè)，這些靶點(diǎn)與網(wǎng)絡(luò)中其他靶點(diǎn)聯(lián)系密切，能代表靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的功能，是參苓白術(shù)散藥效作用的重要靶點(diǎn)(表2)，對(duì)其行GO和KEGG通路富集分析，以了解其在系統(tǒng)水平上的功能。

注：節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)蛋白，邊表示蛋白間相互作用，節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的度值越大；邊越粗、顏色越深，對(duì)應(yīng)蛋白間聯(lián)系程度越高Note: nodes represent target protein, the edge represents interaction between proteins, the larger the node and the darker the color, the greater the degree of corresponding target; the thicker the edge and the darker the color, the higher the degree of connection between corresponding proteins圖2 靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)Fig 2 PPI network of targets

表2 重要靶點(diǎn)信息Tab 2 Information of important targets

2.4 富集分析

26個(gè)重要靶點(diǎn)共富集到60個(gè)GO-BP條目，主要涉及機(jī)體對(duì)血管緊張素的反應(yīng)，血液循環(huán)的良性調(diào)節(jié)，腎上腺素及其受體、G蛋白偶聯(lián)受體以及類固醇激素受體活性等，選取靶點(diǎn)基因占比居前15位的條目進(jìn)行展示，見(jiàn)圖3。重要靶點(diǎn)富集到22條KEGG通路，涉及白細(xì)胞介素17(IL-17)、B細(xì)胞、腫瘤壞死因子(TNF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、腎上腺素和催乳素等信號(hào)通路，以及多種病毒、細(xì)菌相關(guān)疾病的信號(hào)通路，選取靶點(diǎn)基因占比居前15位的條目展示，見(jiàn)圖4。

圖3 GO-BP富集分析部分結(jié)果Fig 3 Partial results of GO-BP enrichment analysis

圖4 KEGG通路富集分析部分結(jié)果Fig 4 Partial results of KEGG pathway enrichment analysis

2.5 分子對(duì)接結(jié)果

分子對(duì)接技術(shù)用計(jì)算機(jī)模擬預(yù)測(cè)小分子化合物與特定受體在不同結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)的親和力，廣泛應(yīng)用于藥物篩選。本研究將二氫槲皮素、山柰酚、木犀草素、7-甲氧基-2-甲基-異黃酮及豆甾醇分別與ACE2、PLP和Mpro進(jìn)行分子對(duì)接，探索上述活性成分是否具有預(yù)防再度感染嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)的能力。除PLP和7-甲氧基-2-甲基-異黃酮外，其他成分與靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合能量均低于原配體，說(shuō)明參苓白術(shù)散的核心成分具備與COVID-19靶點(diǎn)結(jié)合的潛力，可能可預(yù)防“復(fù)感”；其中，PLP與二氫槲皮素結(jié)合程度最好，結(jié)合能量為-365.84 kJ/mol，見(jiàn)表3、圖5。

表3 分子對(duì)接結(jié)果Tab 3 Results of molecular docking

A.ACE2-二氫槲皮素；B.PLP-二氫槲皮素；C.Mpro-木犀草素A.ACE2-dihydroquercetin; B.PLP-kaempferol; C.Mpro-luteolin圖5 分子對(duì)接Fig 5 Molecular docking

3 討論

本研究通過(guò)對(duì)參苓白術(shù)散靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的分析，提煉出26個(gè)重要靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)富集在免疫、循環(huán)和神經(jīng)-內(nèi)分泌相關(guān)生物學(xué)功能及信號(hào)通路上。首先，IL-17、B細(xì)胞和TNF通路相互交錯(cuò)，調(diào)控免疫炎癥反應(yīng)。IL-17由輔助性T細(xì)胞17(Th17)產(chǎn)生，能募集B細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，促進(jìn)炎癥因子釋放，啟動(dòng)“炎癥瀑布”，激化肺部炎癥并導(dǎo)致肺纖維化[9]。第二，VEGF高表達(dá)導(dǎo)致呼吸道黏膜血管新生及通透性增加，增加炎癥因子滲入，導(dǎo)致呼吸道壁增厚，促進(jìn)肺纖維化[10]。第三，血管緊張素引起肺內(nèi)血管收縮、血流量降低是導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征的重要原因，而氧化應(yīng)激是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)的上游調(diào)節(jié)劑[11]。第四，腎上腺素能β2受體的激活能緩解支氣管痙攣，抗炎、抗過(guò)敏，改善通氣。最后，靶點(diǎn)還富集到多種病毒、細(xì)菌感染疾病的信號(hào)通路上，提示參苓白術(shù)散可能對(duì)體虛患者繼發(fā)其他病毒、細(xì)菌感染有一定預(yù)防作用。

本研究篩選出的5個(gè)核心成分，二氫槲皮素、木犀草素、山柰酚、7-甲氧基-2-甲基-異黃酮及豆甾醇，均屬于黃酮類化合物，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗凋亡及抗惡性腫瘤等藥理活性[12]；豆甾醇為天然甾醇，具有降脂、抗菌、抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫及抗氧化等作用[13]?？梢园l(fā)現(xiàn)，核心活性成分的藥理作用與重要靶點(diǎn)的生物功能相契合，黃酮類化合物具有廣譜抗病原微生物活性，故可大膽預(yù)測(cè)，參苓白術(shù)散可能具有抗SARS-CoV-2的能力。同時(shí)，該方可能通過(guò)調(diào)節(jié)IL-17等信號(hào)通路抑制免疫損傷、減輕炎癥；下調(diào)VEGF表達(dá)，減輕肺纖維化；緩解氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)RAS系統(tǒng)，改善肺內(nèi)血液循環(huán)與組織缺氧；也可在一定程度上激活支氣管內(nèi)腎上腺素能受體，解痙止咳。分子對(duì)接結(jié)果證明，5個(gè)核心活性成分能與ACE2、PLP和Mpro較緊密地結(jié)合，說(shuō)明上述成分具有預(yù)防病毒再次入侵機(jī)體的潛能，也從側(cè)面佐證了本研究的可信性。

參苓白術(shù)散中的藥物主要?dú)w脾、肺經(jīng)，臨床除了常用于潰瘍性結(jié)腸炎等脾系疾病外，對(duì)于慢性阻塞性肺疾病、呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎等肺系疾病也有確切療效，是肺脾同治的良方[14]。ACE2不僅在Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞高表達(dá)，并且在食道上皮、回結(jié)腸等消化道中也呈高表達(dá)，故呼吸及消化系統(tǒng)皆會(huì)出現(xiàn)癥狀[15]。研究結(jié)果證實(shí)，參苓白術(shù)散能調(diào)節(jié)腸道菌群平衡[16]，可能糾正治療COVID-19期間使用激素造成的腸道菌群失調(diào)。并且，大量輸液易致脾虛證候，部分患者有腹瀉癥狀，參苓白術(shù)散主治脾虛濕泄，使用該方恰如其分。COVID-19發(fā)病與機(jī)體免疫功能不足有很大聯(lián)系，以往的研究結(jié)果顯示，參苓白術(shù)散方中所含的人參皂苷和茯苓多糖是天然的免疫增強(qiáng)劑，有利于瘥后康復(fù)[17]。

綜上所述，本研究從系統(tǒng)生物學(xué)水平闡釋了參苓白術(shù)散通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)和多通路對(duì)機(jī)體發(fā)揮整體調(diào)節(jié)作用，其可能通過(guò)良性調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)、循環(huán)、神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)以及腸道菌群，改善COVID-19恢復(fù)期肺脾氣虛證的乏力、咳嗽、納差、腹脹及便溏等癥狀，促進(jìn)肺部組織修復(fù)，減少肺纖維化，并可能預(yù)防再次感染病毒。因網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法尚存在局限性，如數(shù)據(jù)庫(kù)未完善、藥材間研究偏倚以及無(wú)法考慮活性成分含量和成分間的化學(xué)反應(yīng)等，本研究暫提供理論參考，具體機(jī)制尚需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。