鄭曉彤，劉大軍

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 腎內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110004

缺血性腎病是腎動(dòng)脈狹窄導(dǎo)致灌注壓下降，使其超過(guò)了自動(dòng)調(diào)節(jié)代償能力而引起的缺血性腎損傷。腎缺血加劇會(huì)導(dǎo)致腎小管結(jié)構(gòu)損傷，進(jìn)一步加重腎功能損害，引發(fā)終末期腎病。腎組織缺血缺氧過(guò)程會(huì)引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生大量的活性氧，其與腎組織細(xì)胞成分發(fā)生反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡，而腎細(xì)胞大量凋亡會(huì)引起腎纖維化和炎癥等病理?yè)p傷[1]。脂聯(lián)素是一種脂肪細(xì)胞衍生血管活性肽，在調(diào)節(jié)能量代謝、炎癥反應(yīng)及心肌缺血中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素可通過(guò)激活STAT3，減少活性氧產(chǎn)生，起到保護(hù)心臟的作用[2]；脂聯(lián)素敲除小鼠模型的心肌細(xì)胞凋亡及梗死面積明顯增加，而外源性給予環(huán)形脂聯(lián)素可明顯降低上述影響[3]；重組脂聯(lián)素蛋白還能夠通過(guò)減少活性氧產(chǎn)生，增強(qiáng)抗氧化能力，進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用[4]。本研究旨在探討脂聯(lián)素對(duì)氯化鈷誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 人腎小管上皮細(xì)胞株HK-2細(xì)胞購(gòu)于上海聯(lián)眾生物公司；脂聯(lián)素(C552)購(gòu)于中國(guó)近岸蛋白質(zhì)科技有限公司；氯化鈷(C8661)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；南美胎牛血清，培養(yǎng)基DME/F-12、青-鏈霉素雙抗均購(gòu)于科碩商貿(mào)有限公司；MitoSOXTM Red Mitochondrial Superoxide Indicator試劑盒(M36008)購(gòu)于美國(guó)賽默飛公司；DAPI(4083S)購(gòu)于美國(guó)CST公司；流式凋亡檢測(cè)試劑盒(556547)購(gòu)于美國(guó)BD公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA裂解液、PMSF、SDS-PAGE凝膠試劑盒均購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司；雙色預(yù)染蛋白Marker(26616)購(gòu)于美國(guó)賽默飛公司；一抗抗體白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β(YT2322)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α(YT4689)均購(gòu)于美國(guó)Immunoway公司；IL-6(A0286)購(gòu)于ABclonal公司；β-tubulin(66240-1-Ig)購(gòu)于中國(guó)Proteintech公司；二抗抗體購(gòu)于中國(guó)Proteintech公司。

1.2 儀器 高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Thermo公司)；熒光顯微鏡、全光譜激光共聚焦顯微鏡(日本尼康公司)；流式細(xì)胞檢測(cè)分析儀(美國(guó)BD公司)；Western Blot電泳儀、電轉(zhuǎn)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Azure公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 HK-2細(xì)胞生長(zhǎng)在添加10%胎牛血清的DME/F-12、100.0 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔日更換培養(yǎng)基，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。將細(xì)胞分入4組：正常對(duì)照組，用DME/F-12培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24 h；氯化鈷誘導(dǎo)缺氧模型組，用含600.0 μM氯化鈷[5-6]的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24 h；單獨(dú)脂聯(lián)素處理組，用含2.5 μg/ml脂聯(lián)素[7-8]的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24 h；氯化鈷+脂聯(lián)素聯(lián)合處理組，用600.0 μM氯化鈷處理細(xì)胞，再加入2.5 μg/ml脂聯(lián)素聯(lián)合處理細(xì)胞24 h。

1.4 光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 HK-2細(xì)胞加藥處理24 h后，光鏡下觀察4組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

1.5 活性氧檢測(cè) 將HK-2細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，給予上述4組加藥處理24 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗3次，每孔加入200 μl終濃度為5 μmol/ L的MitoSOX，37℃避光孵育10 min。再用PBS清洗3次，加入DAPI染色5 min后，PBS清洗3次，用全光譜激光共聚焦顯微鏡觀察各組熒光強(qiáng)度變化并拍照。激發(fā)波長(zhǎng)為510 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為580 nm，所有樣品拍攝參數(shù)保持不變。MitoSOX熒光強(qiáng)度反映線粒體超氧化物生成量，即活性氧的表達(dá)量。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè) HK-2細(xì)胞以每孔1×105個(gè)/L接種于六孔板。在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中加藥處理培養(yǎng)24 h后，棄掉培養(yǎng)基，PBS清洗3次。以2 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，加入500 μl的Binding Buffer重懸細(xì)胞，再加入5 μl磷脂結(jié)合蛋白AnnexinV-FITC混勻后，加入5 μl碘化丙啶Propidium lodide混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Western Blot檢測(cè) 取分組后的HK-2細(xì)胞，用含有蛋白酶抑制劑混合物的細(xì)胞裂解液溶解，收集蛋白上清，BCA蛋白濃度測(cè)定法進(jìn)行定量。將20 μg提取的總蛋白樣品用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，再電轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，加脫脂牛奶室溫封閉2 h后，分別加入一抗IL-1β(1∶1 000)、IL-6(1∶500)、TNF-α(1∶500)及β-tubulin(1∶20 000)，4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次后加相應(yīng)二抗37℃下孵育2 h，TBST清洗3次，電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。采用Image J圖像分析軟件分析蛋白條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 4組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 光鏡下，正常對(duì)照組細(xì)胞呈梭形，胞膜完整，生長(zhǎng)良好。氯化鈷誘導(dǎo)缺氧模型組細(xì)胞形態(tài)明顯變圓，細(xì)胞皺縮，出現(xiàn)細(xì)胞碎片，即細(xì)胞發(fā)生了凋亡和壞死。單獨(dú)脂聯(lián)素處理組細(xì)胞形態(tài)無(wú)變化。氯化鈷+脂聯(lián)素聯(lián)合處理組大部分細(xì)胞形態(tài)由圓形恢復(fù)至梭形，但仍有少量細(xì)胞碎片。見(jiàn)圖1。

圖1 4組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化(200倍)

2.2 4組細(xì)胞活性氧檢測(cè) 正常對(duì)照組和單獨(dú)脂聯(lián)素處理組的HK-2細(xì)胞呈現(xiàn)微弱的紅色MitoSOX熒光；氯化鈷誘導(dǎo)缺氧模型組的HK-2細(xì)胞呈現(xiàn)明亮的紅色熒光，而氯化鈷+脂聯(lián)素聯(lián)合處理組紅色熒光的強(qiáng)度明顯弱于氯化鈷誘導(dǎo)缺氧模型組。見(jiàn)圖2。

圖2 4組細(xì)胞MitoSOX熒光圖像(400倍)

2.3 4組細(xì)胞凋亡率比較 與正常對(duì)照組比較，氯化鈷誘導(dǎo)缺氧模型組、氯化鈷+脂聯(lián)素聯(lián)合處理組的細(xì)胞凋亡率均明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與氯化鈷誘導(dǎo)缺氧模型組比較，氯化鈷+脂聯(lián)素聯(lián)合處理組的細(xì)胞凋亡率明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 4組細(xì)胞凋亡率比較

2.4 4組細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平比較 與正常對(duì)照組比較，氯化鈷誘導(dǎo)缺氧模型組IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與氯化鈷誘導(dǎo)缺氧模型組比較，氯化鈷+脂聯(lián)素聯(lián)合處理組IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 4組細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

脂聯(lián)素在調(diào)節(jié)能量代謝和炎癥反應(yīng)中起重要作用，且其在多個(gè)器官、系統(tǒng)的疾病中發(fā)揮關(guān)鍵性的保護(hù)效能。本研究結(jié)果中,單獨(dú)脂聯(lián)素處理組細(xì)胞形態(tài)無(wú)變化；氯化鈷誘導(dǎo)缺氧模型組細(xì)胞形態(tài)明顯變圓，細(xì)胞皺縮，出現(xiàn)細(xì)胞碎片，即細(xì)胞發(fā)生了凋亡和壞死；氯化鈷+脂聯(lián)素聯(lián)合處理組大部分細(xì)胞形態(tài)由圓形恢復(fù)至梭形，但仍有少量細(xì)胞碎片。這表明，脂聯(lián)素可以改善氯化鈷誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞形態(tài)變化。

在缺血性腎病的發(fā)生過(guò)程中，腎組織長(zhǎng)期缺血缺氧，導(dǎo)致氧化應(yīng)激加劇，活性氧增加，過(guò)量的活性氧對(duì)細(xì)胞成分造成損害，引起大量腎細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果中,正常對(duì)照組和單獨(dú)脂聯(lián)素處理組的HK-2細(xì)胞呈現(xiàn)微弱的紅色MitoSOX熒光；氯化鈷誘導(dǎo)缺氧模型組的HK-2細(xì)胞呈現(xiàn)明亮的紅色熒光，而氯化鈷+脂聯(lián)素聯(lián)合處理組紅色熒光的強(qiáng)度明顯弱于氯化鈷誘導(dǎo)缺氧模型組。這表明，脂聯(lián)素具有明顯的抑制活性氧生成的作用。有研究報(bào)道，脂聯(lián)素發(fā)揮腎保護(hù)作用與其抑制氧化應(yīng)激有關(guān)[9-10]。Ding等[11]研究發(fā)現(xiàn)，活性氧作為一種誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的重要調(diào)節(jié)因子，在外源性補(bǔ)充脂聯(lián)素后，產(chǎn)生明顯減少。

細(xì)胞凋亡與各種器官、系統(tǒng)的發(fā)育及疾病病程等均有著密切聯(lián)系。本研究結(jié)果中,與正常對(duì)照組比較，氯化鈷誘導(dǎo)缺氧模型組、氯化鈷+脂聯(lián)素聯(lián)合處理組的細(xì)胞凋亡率均明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與氯化鈷誘導(dǎo)缺氧模型組比較，氯化鈷+脂聯(lián)素聯(lián)合處理組的細(xì)胞凋亡率明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這表明，脂聯(lián)素具有抑制氯化鈷誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的作用。Cheng等[12]發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素可通過(guò)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α/血紅素加氧酶-1依賴通路，作用于腎小管，發(fā)揮抑制凋亡的作用，從而保護(hù)腎免受缺血再灌注損傷。

除了細(xì)胞凋亡，炎癥反應(yīng)也是缺氧損傷后的一種重要病理過(guò)程。腎細(xì)胞發(fā)生缺氧損傷會(huì)刺激氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生，從而引發(fā)炎癥[1]。IL-1β、IL-6、TNF-α都是公認(rèn)的炎癥因子[13-15]。本研究結(jié)果中,與正常對(duì)照組比較，氯化鈷誘導(dǎo)缺氧模型組IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與氯化鈷誘導(dǎo)缺氧模型組比較，氯化鈷+脂聯(lián)素聯(lián)合處理組IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這表明，脂聯(lián)素對(duì)氯化鈷誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)具有抑制作用。有研究報(bào)道，在培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中，缺氧會(huì)導(dǎo)致IL-1β表達(dá)增加[16]。而脂聯(lián)素可以在降低TNF-α、IL-1表達(dá)水平的同時(shí)減輕胰島素抵抗[17]。Dikmen等[18]在急性胰腺炎模型中發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素可以明顯抑制TNF-α、IL-1β及IL-6的表達(dá)。

綜上所述，脂聯(lián)素可能通過(guò)減少活性氧的產(chǎn)生抑制氯化鈷誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)。因此，將脂聯(lián)素作為治療缺血性腎病的新靶點(diǎn)，可能會(huì)為腎內(nèi)科疾病的臨床治療提供新的思路。