李軍，吳霽蓂，高廣春，朱志明，李白，蔣琦，周鴻宇

關(guān)鍵詞：番紅花;柱頭;突變體;轉(zhuǎn)錄組

中圖分類號：S567.23+9文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2021）06-1630-03

Transcriptome analysis of saffron mutant Cs5 with multiple stigmas

LI Jun1，WU Ji-ming2，GAO Guang-chun2，ZHU Zhi-ming3，LI Bai4，JIANG Qi2，ZHOU Hong-yu2

（1. School of Modern Agriculture， Jiaxing Vocational & Technical College， Jiaxing 314036， China;2.School of Medicine Science， Jiaxing University， Jiaxing 314001， China;3.Jiaxing Xiuzhou Tianhe Saffron Professional Cooperative， Jiaxing 314000， China;4.Jiaxing Academy of Agricultural Sciences， Jiaxing 314016， China）

Key words： saffron;stigma;mutant;transcriptome

番紅花（Crocus sativus L.）為鳶尾科番紅花屬球莖類藥用植物，以其干燥柱頭入藥，具有活血化瘀、解郁安神、涼血解毒等功效，同時也應(yīng)用于食品、化妝品行業(yè)染料及香料的制作[1-2]。番紅花在浙江、江蘇、上海、四川等地廣泛栽培，但全國種植面積不到667 hm2，占市場需求量的20%左右，大部分還是依賴進口，因此番紅花的需求量非常大。然而，由于番紅花為三倍體雄性不育植物，僅靠球莖進行營養(yǎng)繁殖，而且每一朵花只有3個柱頭，所以產(chǎn)量極低[3-4]。因此，培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的番紅花品種將有效緩解國內(nèi)外番紅花市場的供求矛盾，具有重要的基礎(chǔ)理論研究價值和產(chǎn)業(yè)應(yīng)用前景。

野生型番紅花的花為頂生;花被片6個，淡紫色，長4～6 cm;雄蕊3個，雌蕊三心皮合生，子房下位，花柱細長，黃色柱頭3個，伸出花被筒外后下垂，深紅色，頂端略膨大。本研究在番紅花生產(chǎn)過程中發(fā)現(xiàn)了多柱頭突變體Cs5，其雌蕊上端花柱和柱頭數(shù)量均為5個，形態(tài)與野生型無異，花柱聚合后比野生型粗壯（圖1）。柱頭數(shù)量的增多有助于提高番紅花花絲的產(chǎn)量及花農(nóng)收入，是番紅花新品種培育的主要方向。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)，結(jié)合共表達網(wǎng)絡(luò)分析番紅花柱頭發(fā)育的調(diào)控基因AGL6，發(fā)現(xiàn)其可能通過影響花器官的發(fā)育進而影響柱頭的生物量，最終影響次生代謝物的產(chǎn)量[2，5-6]。番紅花柱頭數(shù)量是影響產(chǎn)量的一個重要指標，調(diào)控其生長發(fā)育的結(jié)構(gòu)基因的挖掘和調(diào)控機制的研究有助于解決番紅花資源短缺問題，然而目前相關(guān)研究報道較少。

目前，RNA-Seq分析測試技術(shù)在植物特異突變、特定發(fā)育時期以及不同組織器官基因差異表達等方面的研究中廣泛應(yīng)用[7-9]。本研究擬對番紅花多柱頭突變體Cs5柱頭及其野生型柱頭進行轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學(xué)比較分析，篩選差異表達基因，分析基因功能以及相關(guān)的代謝通路，以期為研究影響番紅花柱頭數(shù)量的相關(guān)調(diào)控基因及相關(guān)信號通路提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

番紅花多柱頭突變體Cs5樣本為浙江省嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院番紅花種植基地里的自然突變體，其雄蕊、花柱和柱頭的數(shù)量均為5個，均比野生型多2個。于盛花期分別采集番紅花多柱頭突變體Cs5和野生型番紅花的柱頭，每10個1組，設(shè)3次重復(fù)，于-80 ℃超低溫冰箱中凍存，用于后續(xù)試驗。

取各處理組的樣品各0.1 g，液氮研磨，采用PureLink Plant RNAReagent Kit試劑盒（Invitrogen公司產(chǎn)品）提取柱頭的總RNA，在Illumina HiSeq2500儀器（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品）上進行RNA-Seq測序。

1.2差異表達基因分析和功能注釋

采用Trinity軟件將各處理組的有效數(shù)據(jù)組裝成對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本序列，用Blast軟件將各樣品測序得到的所測讀段與Unigene庫進行比對，利用DESeq軟件以錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）≤0.05且log2 Fold Change≥1為條件篩選差異表達基因（DEGs）。使用Blast軟件將DEGs與NR、SWISS、GO、COG、KEGG數(shù)據(jù)庫信息進行比對，獲得相應(yīng)的注釋信息。

1.3差異表達基因的驗證及表達模式分析

分別選取10個差異表達基因，利用實時熒光定量PCR驗證測序數(shù)據(jù)的可靠性，以及差異表達基因在花瓣、葉片、球莖、雄蕊、柱頭等不同組織中的表達模式。實時熒光定量PCR：總反應(yīng)體積20 μl，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)數(shù)為40個，72 ℃延伸30 s。用2-△△Ct計算基因表達差異。

差異表達基因?qū)崟r熒光定量PCR驗證和表達模式分析的數(shù)據(jù)用GraphPad Prism5.0軟件進行統(tǒng)計處理，采用One-way ANOVA進行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1基因組裝分析

利用Illumina HiSeq2500儀器進行無參轉(zhuǎn)錄組測序，番紅花多柱頭突變體Cs5產(chǎn)生了60 063 054條序列數(shù)，野生型產(chǎn)生了54 706 306條序列數(shù)，各處理組的G、C基本隨機分布，無明顯偏差。質(zhì)量控制分析后，突變體保留54 984 766條序列，野生型保留49 715 722條序列。采用Trinity軟件對數(shù)據(jù)進行組裝，對得到的52 317條Unigenes分別進行功能注釋，其中NR數(shù)據(jù)庫29 392條，GO數(shù)據(jù)庫20 510條，COG數(shù)據(jù)庫21 126條，KEGG數(shù)據(jù)庫12 875條，SWISS數(shù)據(jù)庫20 510條，其中NR數(shù)據(jù)庫注釋比最高，達56.18%。

2.2差異表達基因分析

對番紅花多柱頭突變體Cs5和野生型番紅花的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行差異分析，共篩選出917個差異表達基因，其中番紅花多柱頭突變體Cs5中有412個（約占44.93%）基因表達上調(diào)，505個（約占55.07%）基因表達下調(diào)。顯著差異表達基因中包括MADS家族轉(zhuǎn)錄因子基因15個（包含9個已鑒定的番紅花MADS類轉(zhuǎn)錄因子基因），MYB家族轉(zhuǎn)錄因子基因19個，BHLH家族轉(zhuǎn)錄因子基因7個，WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子基因5個，SEUSS家族轉(zhuǎn)錄因子基因6個，TF1轉(zhuǎn)錄因子基因1個，與植物激素相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因23個，這些轉(zhuǎn)錄因子基因大多與植物花發(fā)育相關(guān)。

2.3實時熒光定量PCR驗證差異表達基因

為了進一步驗證測序結(jié)果的可靠性，從917個差異表達基因中隨機選擇10個差異表達基因（包含3個上調(diào)表達基因，7個下調(diào)表達基因）進行實時熒光定量PCR驗證，與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比較后發(fā)現(xiàn)，這10個基因的表達情況與測序結(jié)果一致，說明本次轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果真實可信。

2.4DEGs的GO功能注釋分析

對番紅花多柱頭突變體DEGs進行GO功能注釋分析，有316個基因被注釋到41個分類條目上，包括145個上調(diào)基因和171個下調(diào)基因。這些基因功能分為生物過程、細胞組分和分子功能3大類，分別包含141、103、72個條目。對這3類條目的二級分類結(jié)果進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)DEGs在生物過程條目中主要分布在細胞過程和代謝過程，在細胞組分條目中主要包括共質(zhì)體和細胞膜等，在分子功能條目中主要包括結(jié)合活性和催化活性。

2.5DEGs的KEGG功能注釋分析

通過與KEGG數(shù)據(jù)庫比對，對所有DEGs進行功能注釋和富集分析。結(jié)果顯示，917個差異表達基因被富集在179個代謝通路中，以校正P值<0.05為條件篩選出20個顯著富集的代謝通路，包括次生代謝產(chǎn)物生物合成、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA轉(zhuǎn)運、淀粉和蔗糖代謝等。植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中富集了5個差異表達基因，涉及生長素、赤霉素、脫落酸的代謝通路，植物激素在植物生長發(fā)育的不同時期和不同組織器官中均發(fā)揮重要的作用，番紅花多柱頭突變體Cs5的性狀很有可能與激素表達、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)。

2.6DEGs表達模式分析

從917個差異表達基因中隨機選取10個差異表達基因，通過實時熒光定量PCR技術(shù)分析其在番紅花不同組織器官里的表達情況。本研究結(jié)果表明，DN34196、DN30594、DN41391、DN24459和DN39219共5個差異表達基因在番紅花柱頭中的表達量與其在雄蕊、花瓣、葉片和球莖中的表達量有極顯著差異（P<0.01）;DN26020在番紅花柱頭中的表達量與其在雄蕊和花瓣中的表達量無顯著差異，與其在葉片和球莖中的表達量存在極顯著差異（P<0.01）;DN17686和DN31280在柱頭中的表達量與其在葉片中的表達量無顯著差異，與其在雄蕊、花瓣和球莖中的表達量存在極顯著差異（P<0.01）。

3討論

番紅花作為經(jīng)濟價值極高的藥用植物，藥用部位的產(chǎn)量一直是科研人員關(guān)注的焦點[10-11]。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對番紅花多柱頭突變體Cs5柱頭和野生型番紅花柱頭進行轉(zhuǎn)錄組分析，從中發(fā)現(xiàn)可能與柱頭發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子包括MADS家族、MYB家族、BHLH家族、WRKY家族、SEUSS家族以及與植物激素相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。另外，番紅花突變體中MADS-box基因包含A Class （AP1）、B Class （PI/AP3）、C Class（AG）、D Class（AGL）和E Class（SEP），說明番紅花花發(fā)育過程也涉及到5類基因在不同時間和空間的精確表達[6]。

植物自身激素水平在雌蕊發(fā)育過程中扮演著重要角色，本研究發(fā)現(xiàn)一批與生長素、赤霉素、細胞分裂素和脫落酸的合成、失活及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，通過這些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控可以維持植物包括雌蕊在內(nèi)的花器官的正常發(fā)育[12-13]。番紅花柱頭的發(fā)育質(zhì)量和數(shù)量直接影響其經(jīng)濟價值，多柱頭突變體的發(fā)現(xiàn)一方面可以為通過組培快繁技術(shù)快速擴繁突變體數(shù)量，提高番紅花產(chǎn)量的研究提供試驗材料，另一方面本研究獲得的轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)使得解析多柱頭突變體形成機制，以及通過生物技術(shù)調(diào)控、創(chuàng)制更多突變體成為了可能。隨著基因組﹑轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及分子生物學(xué)技術(shù)的不斷提高，相信將來在番紅花柱頭生長發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)上的一些蛋白質(zhì)生物學(xué)功能和基因間互作關(guān)系的研究會有更大突破。

參考文獻：

[1]SHAHI T， ASSADPOUR E， JAFARI S M. Main chemical compounds and pharmacological activities of stigmas and tepals of ‘red gold’; saffron[J]. Trends in Food Science & Technology， 2016， 58： 69-78.

[2]陳祥慧，譚何新，張磊.西紅花中類胡蘿卜素生物合成途徑研究進展[J].中草藥，2018，49（19）：4702-4709.

[3]朱嬌，張永春，周琳，等. 不同光周期對西紅花開花和花絲品質(zhì)的效應(yīng)比較[J]. 西北植物學(xué)報，2021， 41（3）：431-438.

[4]DOUGLAS M H， SMALLFIELD B M， WALLACE A R， et al. Saffron （Crocus sativus L.）： The effect of mother corm size on progeny multiplication， flower and stigma production [J]. Scientia Horticulturae， 2014， 166：50-58.

[5]NING K， HAN Y Y， CHEN Z J， et al. Genome-wide analysis of MADS-box family genes during flower development in lettuce[J]. Plant Cell and Environment， 2019， 42（6）： 1868-1881.

[6]SHEN X， ZHAO Z， WANG J， et al. Genome wide analysis of MADS-box gene family in Brassica oleracea reveals conservation and variation in flower development[J]. BMC Plant Biology， 2019， 19： 106.

[7]LI J， YE C， CHANG C. Comparative transcriptomics analysis revealing flower trichome development during flower development in two Lonicera japonica Thunb. cultivars using RNA-seq [J]. BMC Plant Biology， 2020， 20：341.

[8]DENG M H， ZHAO K， LV J H， et al. Flower transcriptome dynamics during nectary development in pepper（Capsicum annuum L.） [J]. Gnentics and Molecular Biology， 2020， 43（2）：e20180267.

[9]HUANG S， LIU Z， LI C， et al. Transcriptome analysis of a female-sterile mutant （fsm） in Chinese cabbage （Brassica campestris ssp. pekinensis）[J]. Frontiers in Plant Science， 2017， 8：546.

[10]王楨，張永春，楊柳燕，等. 西紅花組織培養(yǎng)研究進展[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2019， 35（12）：100-106.

[11]陳瑩，張怡婷，開國銀，等. 西紅花等級標準與抗腫瘤藥效的研究進展[J]. 植物生理學(xué)報，2021，57（7）：1385-1392.

[12]CUCINOTTA M， CAVALLERI A， WILLIAM C J， et al. Auxin and Flower development： a blossoming field [J]. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology， 2020， 13：a039974.

[13]ARROM L， MUNN-BOSHCH S. Hormonal changes during flower development in floral tissues of Lilium [J]. Planta， 2012， 236（2）：343-354.

（責(zé)任編輯：王妮）

收稿日期：2021-04-12

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（81703667）;嘉興市公益性研究計劃項目（2020AY10023）;浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新計劃項目（2020R417016）;嘉興市科技特派員專項項目（2021K117）;嘉興學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)能力個性化培養(yǎng)項目

作者簡介：李軍（1981-），男，山東泰安人，博士，副研究員，主要從事植物分子生物學(xué)研究。（E-mail）lijunjx1@163.com

通訊作者：高廣春，（E-mail）gaogcjx@163.com