俞咪娜，于俊杰，曹慧娟，潘夏艷，宋天巧，劉永鋒

摘要：為明確Zn2（Ⅱ）Cys6型轉(zhuǎn)錄因子UvZC1在稻曲病病菌中的功能，利用CRISPR-Cas9結(jié)合同源片段雙交換的方法，誘導(dǎo)野生型菌株Jt209發(fā)生UvZC1基因缺失突變。結(jié)果顯示，與Jt209相比，UvZC1基因缺失突變體的生長速率和分生孢子量均顯著下降，且突變體中部分與稻曲病病菌其他產(chǎn)分生孢子相關(guān)基因表達(dá)量發(fā)生變化;此外，該基因的缺失導(dǎo)致突變體對(duì)十二烷基硫酸鈉（SDS）更敏感，而對(duì)氧化脅迫的耐受性增強(qiáng);在稻曲病病菌接種水稻后24 h、48 h的侵染早期，UvZC1基因的表達(dá)量明顯上升，但基因缺失突變體接種水稻后形成的稻曲球數(shù)量與野生型之間沒有差異。綜上所述，UvZC1基因參與稻曲病病菌營養(yǎng)生長、分生孢子產(chǎn)生和侵染水稻過程，還與稻曲病病菌細(xì)胞壁的完整性和響應(yīng)氧化脅迫相關(guān)。

關(guān)鍵詞：稻曲病病菌;Zn2（Ⅱ）Cys6轉(zhuǎn)錄因子UvZC1;基因敲除;基因功能;致病性

中圖分類號(hào)：S511.01文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2021）06-1400-09

Clone and functional research of Zn2（Ⅱ） Cys6 transcription factor UvZC1 gene in Ustilaginoidea virens

YU Mi-na，YU Jun-jie，CAO Hui-juan，PAN Xia-yan，SONG Tian-qiao，LIU Yong-feng

（Institute of Plant Protection， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）

Abstract：In order to clarify the function of Zn2（Ⅱ） Cys6 transcription factor UvZC1 in Ustilaginoidea virens， gene deletion mutation was carried out by the CRISPR-Cas9-based homologous recombination system. Compared with the wild-type strain Jt209， the growth rate and conidia production of △UvZC1 mutants were significantly decreased， and the expression levels of genes related to the sporulation of U. virens were also changed. In addition， the UvZC1 deletion mutants showed more sensitivity to sodium dodecyl sulfate （SDS）， and the tolerance to oxidative stress was enhanced. At the early stage of infection （24 h and 48 h after inoculation）， the expression of UvZC1 gene increased significantly. However， no significant difference in the number of rice false smut balls between the wild type and the △UvZC1 mutants was found. Overall， UvZC1 gene has roles in regulating hyphal growth， conidiation， cell wall integrity and oxidative stress response in U. virens. Furthermore， UvZC1 gene is also involved in the infection process of U. virens.

Key words：Ustilaginoidea virens;Zn2（Ⅱ）Cys6 transcription factor UvZC1;gene knocking-out;gene function;pathogenicity

稻曲?。≧ice false smut）是由稻曲病病菌[Ustilaginoidea virens （Cooke） Tak.]侵染引起的一種世界性水稻穗部病害，在世界各水稻主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。近年來，稻曲病在中國逐漸成為水稻的主要病害之一，年平均發(fā)病面積達(dá)3.06×106hm2，造成水稻年減產(chǎn)1.586×108 kg，尤其在長江中下游地區(qū)，稻曲病重發(fā)的水稻種植面積占水稻總種植面積的19%～40%[1]。稻曲病的發(fā)生會(huì)影響谷粒的營養(yǎng)運(yùn)輸和正常發(fā)育，造成空秕率升高、千粒質(zhì)量下降[2-3];而稻曲球中含有的稻曲菌素更能抑制微管蛋白的組裝，并干擾細(xì)胞骨架形成，引起人畜病變[4-5]。深入研究稻曲病病菌致病相關(guān)基因功能，對(duì)解析稻曲病病菌致病機(jī)制、選擇防治策略具有重要意義。

轉(zhuǎn)錄因子是一類調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄起始的重要蛋白質(zhì)，稻曲病病菌轉(zhuǎn)錄因子UvHOX2的基因敲除突變體菌株不產(chǎn)生厚垣孢子，且分生孢子產(chǎn)量下降，致病力減弱[6]。轉(zhuǎn)錄因子UvCmo1、UvHog1參與稻曲病病菌響應(yīng)非生物脅迫、致病等多個(gè)重要生物學(xué)過程[7-8]。Zn2（Ⅱ）Cys6型轉(zhuǎn)錄因子是子囊菌中最大的一類轉(zhuǎn)錄因子，其結(jié)構(gòu)中包含1個(gè)CX2CX6CX5-12-CX2CX6-8C基序，可以與2個(gè)鋅離子結(jié)合，該類蛋白質(zhì)只存在于真菌界[9]。Zhang等[10]用稻曲病病菌接種水稻孕穗期的穗部，在轉(zhuǎn)錄組水平分析接種的水稻穗部發(fā)現(xiàn)，編碼Zn2（Ⅱ）Cys6型轉(zhuǎn)錄因子1（Ustilaginoidea virens Zn2Cys6 transcription factors 1， KDB18664）的UvZC基因在侵染早期的表達(dá)量顯著升高，據(jù)此推測，該基因與稻曲病病菌侵染相關(guān)。目前UvZC1基因在稻曲病病菌中的生物學(xué)功能尚不明確，本研究通過分析該基因敲除突變體菌株的表型，對(duì)稻曲病病菌中UvZC1基因的功能進(jìn)行解析，以期為稻曲病病菌致病機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試材料

Jt209菌株分離自2018年從江蘇金壇田間采集的稻曲病病株標(biāo)樣，經(jīng)單孢純化和測序鑒定為稻曲病病菌后保存[11]。供試水稻品種為稻曲病感病品種兩優(yōu)培九。在田間用Jt209菌株接種兩優(yōu)培九后表現(xiàn)出強(qiáng)致病力。敲除載體pCas9-gRNA由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)張海峰教授惠贈(zèng)，回補(bǔ)載體pKO1-Neo由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。稻曲病病菌用馬鈴薯蔗糖瓊脂（PSA）培養(yǎng)基活化和培養(yǎng)，YT培養(yǎng)基用于稻曲病病菌生物學(xué)特性的觀察分析[8，12]。稻曲病病菌的培養(yǎng)條件為28 ℃、避光。

1.2稻曲病病菌UvZC1基因的克隆與分析

將新活化的Jt209菌株在YT培養(yǎng)液中搖動(dòng)培養(yǎng)5 d，過濾并收集菌絲。用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取Jt209總基因組;用RNA提取試劑盒（Bioteke，PR1202）提取Jt209總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，RR047）將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。參考稻曲病病菌Uv8b菌株的全基因組序列，設(shè)計(jì)UvZC1基因的全長擴(kuò)增引物UvZC1 F、UvZC1 R，以Jt209基因組和cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增分別獲得UvZC1基因及cDNA全長序列并測序。將序列在美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST同源比對(duì)，用CDART進(jìn)行基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域分析，用MEGA 7構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3稻曲病病菌UvZC1基因敲除和回補(bǔ)突變體的獲得

通過1F/1R引物對(duì)、2F/2R引物對(duì)對(duì)Jt209基因組進(jìn)行擴(kuò)增，分別獲得964 bp UvZC1基因上游片段和998 bp下游片段;用引物對(duì)hyg1.4F/hyg1.4R從質(zhì)粒pSK044中擴(kuò)增獲得潮霉素抗性基因（HPH）片段，通過多片段重組酶（C113-02）連接獲得基因敲除載體pMD19T-HPH-UvZC1。CRISPR載體構(gòu)建和稻曲病病菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化參考Liang等[13]的方法。經(jīng)潮霉素抗性初篩獲得轉(zhuǎn)化子，通過RT-UvZC1 F/RT-UvZC1 R、hyg1.4F/yzR和hyg1.4R/yzF特異性引物對(duì)擴(kuò)增轉(zhuǎn)化子基因組進(jìn)行再次擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行測序和序列比對(duì)。利用地高辛標(biāo)記的Southern雜交方法對(duì)UvZC1基因敲除突變體菌株的基因組DNA進(jìn)行分析，Jt209和突變體基因組DNA的提取參照方法1.2進(jìn)行;探針的制備采用hyg1.4F/hyg1.4R引物對(duì)經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得的HPH基因片段;利用Xho I單酶切基因組DNA，按照Roche DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I試劑盒的說明書進(jìn)行Southern雜交，明確UvZC1基因敲除突變體菌株中HPH基因的插入拷貝數(shù)。

為了獲得基因回補(bǔ)突變體，用引物對(duì)CF/CR擴(kuò)增Jt209基因組，獲得包含基因上游1.9 kb的片段、基因全長和基因下游0.5 kb的片段，連接獲得回補(bǔ)載體pKO1-Neo-UvZC1，測序正確后，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的稻曲病病菌轉(zhuǎn)化方法將目的基因轉(zhuǎn)化至UvZC1基因敲除突變體菌株上[11]，用遺傳霉素G418篩選轉(zhuǎn)化子，再用RT-UvZC1 F/RT-UvZC1 R引物對(duì)進(jìn)行轉(zhuǎn)化子中UvZC1基因表達(dá)量的測定，篩選回補(bǔ)菌株。所用引物序列見表1。

1.4稻曲病病菌生物學(xué)表型的測定

將稻曲病病菌菌株在PSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d后，在菌落生長邊緣處取菌碟（直徑為5 mm），用于生物學(xué)表型的測定。每個(gè)菌設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.1菌絲生長速率的測定將菌碟接種至YTA培養(yǎng)基上，于28 ℃避光培養(yǎng)12 d后觀察菌落形態(tài)，測量菌落直徑。

1.4.2菌絲對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)試驗(yàn)分別將菌碟接種至含0.3 mol/L NaCl、0.3 mol/L KCl、0.8 mol/L D-山梨醇（Sorbitol）、70 μg/ml 剛果紅（Congo Red）、0.005% 十二烷基硫酸鈉（SDS）和3 mmol/L H2O2的YTA培養(yǎng)基上，28 ℃避光培養(yǎng)12 d后測量菌落直徑。

1.4.3分生孢子產(chǎn)生量的測定取菌碟后將其接至含有50 ml YTS培養(yǎng)液的100 ml三角瓶中，每瓶接種5粒菌碟，于28 ℃、160 r/min搖動(dòng)培養(yǎng)7 d，用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)分生孢子數(shù)量。

1.5致病力的測定

稻曲病病菌致病力的檢測參考張君成等[13]的方法，將搖動(dòng)培養(yǎng)7 d的培養(yǎng)液作為接種體（分生孢子含量為1 ml 1×106個(gè)）。在兩優(yōu)培九孕穗期（破口前5～7 d），用注射器將菌液注入穗苞，每個(gè)菌株接種12穗，每穗接種1 ml接種體。接種28 d后調(diào)查每穗稻曲球數(shù)，重復(fù)3次。

1.6UvZC1基因表達(dá)的測定

1.6.1分生孢子不同萌發(fā)階段UvZC1基因的表達(dá)用單層Miracloth（Calbiochem，La Jolla CA，USA）過濾搖動(dòng)培養(yǎng)5 d的稻曲病病菌YT培養(yǎng)液，收集分生孢子。分生孢子用無菌水洗滌后，稀釋至終含量為1 ml 1×106個(gè)，取40 μl孢子液并將其涂布于鋪在YTA培養(yǎng)基上的玻璃紙上，于28 ℃避光培養(yǎng)，分別于涂布培養(yǎng)后12 h、18 h、24 h、48 h和72 h取樣，以收集的未涂布的分生孢子作為對(duì)照。提取樣品RNA，用于測定UvZC1基因在孢子不同萌發(fā)階段的表達(dá)量，基因的相對(duì)表達(dá)量通過熒光定量反應(yīng)（qPCR）分析獲得（TaKaRa，RR820）。qPCR反應(yīng)在QuantStudio 3熒光定量PCR儀（Thermo Fisher）中完成。以α-tubulin-1作為內(nèi)參基因，基因表達(dá)量的計(jì)算參照2-△△Ct方法。3次重復(fù)。

1.6.2H2O2脅迫下UvZC1基因的表達(dá)收集分生孢子，按照終含量為1ml 1×106個(gè)接種至YT培養(yǎng)液中，避光搖動(dòng)培養(yǎng)2 d后，加入終濃度為3 mmol/L的H2O2繼續(xù)搖動(dòng)培養(yǎng)，分別于處理后0.5 h、1.0 h收集菌絲，以處理前收集的菌絲為對(duì)照。按照方法1.6.1的基因表達(dá)量檢測方法分析菌絲用H2O2處理后的UvZC1基因表達(dá)情況。

1.6.3接種水稻后侵染初期UvZC1基因的表達(dá)參照方法1.5用Jt209菌株接種兩優(yōu)培九，分別于接種后24 h、48 h取接種的稻穗，以接種前收集的菌絲為對(duì)照。參照方法1.6.1提取接種稻穗的RNA，用熒光定量方法分析UvZC1在2個(gè)侵染時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況。

1.7其他產(chǎn)分生孢子相關(guān)基因在UvZC1基因敲除突變體菌株中表達(dá)量的測定

各取5粒Jt209和UvZC1敲除突變體菌碟，分別接種至含有50 ml YTS培養(yǎng)液的100 ml三角瓶中，28 ℃、160 r/min避光搖動(dòng)培養(yǎng)5 d后，收集菌絲用于RNA提取。按照1.6.1的方法分析其他產(chǎn)分生孢子相關(guān)基因在UvZC1基因敲除突變體菌株中的表達(dá)情況。每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)重復(fù)，同時(shí)本試驗(yàn)重復(fù)3次。被檢測的其他產(chǎn)分生孢子相關(guān)基因及其引物見表2。

2結(jié)果與分析

2.1UvZC1基因在稻曲病病菌侵染早期的表達(dá)模式

由圖1可以看出，UvZC1基因在Jt209接種兩優(yōu)培九24 h和48 h后均有表達(dá)，且基因表達(dá)量在接種后隨著接種時(shí)間的延長顯著上升，接種24 h、48 h時(shí)分別為接種起始階段的9.1倍、16.2倍，表明該基因參與稻曲病病菌早期侵染水稻的過程。

2.2稻曲病病菌UvZC1基因的克隆與序列分析

序列分析結(jié)果顯示，UvZC1基因全長1 458 bp，不含內(nèi)含子，編碼485個(gè)氨基酸。UvZC1的預(yù)測編碼蛋白質(zhì)含有1個(gè)GAL4（smart00066）基序和1個(gè)Fungal_TF_MHR（cl23766）基序，與其他Zn（Ⅱ）2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子相似。蛋白質(zhì)同源性比較結(jié)果顯示，UvZC1與金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）、大孢綠僵菌（Metarhizium majus）等子囊菌的Zn（Ⅱ）2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子的相似度超過65%，與其他絲狀真菌Zn（Ⅱ）2Cys6蛋白的相似度也為50%左右（圖2）。因此確定UvZC1基因編碼的蛋白質(zhì)屬于Zn（Ⅱ）2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子。

A：UvZC1與其他真菌中Zn（Ⅱ）2Cys6轉(zhuǎn)錄因子（括號(hào)內(nèi)數(shù)值表示UvZC1與其他蛋白質(zhì)同源比較的identity值）的系統(tǒng)發(fā)育樹分析;B：UvZC1與其他真菌中Zn（Ⅱ）2Cys6轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析。

2.3UvZC1基因敲除和回補(bǔ)突變體的獲得

以野生型菌株Jt209為對(duì)照，經(jīng)抗性篩選、特異性引物PCR鑒定和Southern雜交分析，共獲得2個(gè)基因敲除突變體菌株（△UvZC1-19和△UvZC1-20）。再以敲除突變體菌株△UvZC1-19為初始菌株，回補(bǔ)UvZC1基因，獲得2個(gè)基因回補(bǔ)菌株（UvZC1 c-1和UvZC1 c-2）。用RT-UvZC1 F/RT-UvZC1 R擴(kuò)增Jt209、敲除突變體和回補(bǔ)菌株的cDNA，發(fā)現(xiàn)UvZC1在Jt209和回補(bǔ)菌株中表達(dá)，而在敲除突變體菌株中不表達(dá)。用HPH基因特異性引物hyg1.4 R/hyg1.4 F只能從敲除突變體和回補(bǔ)菌株的基因組中擴(kuò)增到目的片段，而在Jt209基因組中不能擴(kuò)增到目的片段（圖3）。上述結(jié)果表明，敲除突變體菌株中的UvZC1基因已經(jīng)被潮霉素抗性基因成功替換，回補(bǔ)菌株中的UvZC1基因得到了回補(bǔ)。

A：UvZC1基因敲除載體構(gòu)建;B：Jt209菌株、UvZC1基因敲除突變體和回補(bǔ)菌株中UvZC1和HPH基因PCR檢測;C：Southern雜交檢測基因敲除突變體菌株中HPH基因拷貝數(shù)。a：Jt209;b：△UvZC1;c：△UvZC1c;d：△UvZC1-19;e：△UvZC1-20;f：△UvZC1-66;M：Marker。

2.4UvZC1基因?qū)Φ厩〔【L的影響

由圖4A、圖4B可以看出，在YTA培養(yǎng)基上，△UvZC1-19、△UvZC1-20的菌落直徑分別為（33.44±0.25） mm、（33.75±0.27） mm，與Jt209的（35.55±0.46） mm和回補(bǔ)菌株的（35.77±0.32） mm相比顯著下降，但各菌落間的形態(tài)沒有明顯差異，表明UvZC1基因敲除會(huì)影響稻曲病病菌的生長速率，但不影響菌落形態(tài)。

由圖4C可以看出，在0.3 mol/L NaCl、0.3 mol/L KCl、0.8 mol/L D-山梨醇和70 μg/ml 剛果紅等非生物脅迫下，Jt209、UvZC1基因敲除突變體菌株和回補(bǔ)菌株在生長抑制效果上沒有顯著差異，然而0.005% SDS對(duì)UvZC1基因敲除突變體菌株的抑制率明顯高于Jt209菌株和回補(bǔ)菌株，表明UvZC1基因參與調(diào)節(jié)稻曲病病菌細(xì)胞壁的完整性。

2.5UvZC1基因?qū)Φ厩〔【憫?yīng)氧化脅迫的影響

分析Jt209、UvZC1基因敲除突變體菌株和回補(bǔ)菌株在含3 mmol/L H2O2培養(yǎng)基上的生長抑制率發(fā)現(xiàn)，UvZC1基因敲除突變體對(duì)氧化脅迫的耐受性高于Jt209菌株和回補(bǔ)菌株（圖4A、圖4C）;而Jt209菌株中UvZC1基因的表達(dá)量在3 mmol/L H2O2處理1.0 h時(shí)顯著上升（圖5），表明UvZC1可能參與調(diào)控稻曲病病菌響應(yīng)氧化脅迫的過程。

2.6UvZC1基因?qū)Φ厩〔【a(chǎn)分生孢子的影響

由圖6A可以看出，Jt209、UvZC1基因敲除突變體菌株和回補(bǔ)菌株搖動(dòng)培養(yǎng)產(chǎn)生的分生孢子在形態(tài)、大小、萌發(fā)率等方面沒有顯著差異，但UvZC1基因敲除突變體菌株△UvZC1-19和△UvZC1-20產(chǎn)分生孢子數(shù)量較Jt209分別減少91.1%和89.4%。

由圖6B可以看出，進(jìn)一步分析UvZC1在稻曲病病菌分生孢子萌發(fā)和菌絲生長、分生孢子產(chǎn)生等不同階段的基因表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，UvZC1在孢子萌發(fā)產(chǎn)生芽管及芽管伸長（萌發(fā)時(shí)間18 h）、菌絲伸長（萌發(fā)時(shí)間24 h）階段的表達(dá)量與分生孢子時(shí)期沒有顯著差異;隨著萌發(fā)的菌絲頂端新分生孢子的產(chǎn)生（萌發(fā)時(shí)間48 h、72 h），UvZC1相對(duì)表達(dá)量與分生孢子時(shí)期相比逐漸上升，表明UvZC1參與了稻曲病病菌產(chǎn)分生孢子的過程。

此外，檢測已報(bào)道的稻曲病病菌產(chǎn)分生孢子其他相關(guān)基因的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，與Jt209相比，UvZC1基因敲除突變體菌株中UvAC1、UvSLT2基因的相對(duì)表達(dá)量顯著上升，UvCDC2、UvCom1和UvHog1基因的相對(duì)表達(dá)量顯著下降，UvBI-1基因的相對(duì)表達(dá)量變化不顯著（圖6C）。上述結(jié)果表明，UvZC1可能通過調(diào)節(jié)稻曲病病菌多個(gè)產(chǎn)分子孢子相關(guān)基因，從而參與調(diào)控稻曲病病菌分生孢子的產(chǎn)生。

A：Jt209菌株、UvZC1基因敲除突變體菌株和回補(bǔ)菌株在不同非生物脅迫下的菌落形態(tài);B：在YTA培養(yǎng)基上的菌落直徑;C：在YTA培養(yǎng)基上不同非生物脅迫對(duì)菌株生長的抑制率。

2.7UvZC1基因?qū)Φ厩〔【虏⌒缘挠绊?/p>

田間接種試驗(yàn)結(jié)果顯示，Jt209、UvZC1基因敲除突變體菌株和回補(bǔ)菌株在接種稻穗上產(chǎn)生的稻曲球數(shù)量無顯著差異，稻曲球形態(tài)也無明顯差異（圖7），表明UvZC1基因不影響稻曲球的產(chǎn)生。

3討論

本研究從稻曲病病菌中克隆到UvZC1基因，其編碼蛋白質(zhì)與其他真菌中的Zn（Ⅱ）2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子在序列和結(jié)構(gòu)域上有很高的相似性，均具有包含6個(gè)半胱氨酸的GAL4基序，可以結(jié)合2個(gè)鋅離子，表明UvZC1蛋白是典型的Zn（Ⅱ）2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子[9]。Zn（Ⅱ）2Cys6轉(zhuǎn)錄因子為僅存于真菌中的鋅簇蛋白，在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，含Zn（Ⅱ）2Cys6基序的Moc3蛋白可以與其他蛋白質(zhì)互作，參與調(diào)控酵母有性生殖和DNA完整性[17-18]。在絲狀真菌中，這類蛋白質(zhì)參與真菌菌絲生長、產(chǎn)分生孢子、致病力及對(duì)不良環(huán)境的響應(yīng)等過程，具有多種調(diào)節(jié)功能，但在不同真菌中的功能存在差異[19-24]。

A：不同菌株的產(chǎn)孢量;B：UvZC1基因在分生孢子不同萌發(fā)階段的表達(dá)量;C：UvZC1基因敲除突變體菌株中稻曲病病菌其他產(chǎn)分生孢子相關(guān)基因表達(dá)量。*表示在突變體菌株與野生型菌株間存在顯著差異（P<0.05）。

A：接種后稻穗產(chǎn)稻曲球癥狀;B：每穗平均稻曲球數(shù)。

稻曲病病菌UvZC1基因敲除突變體菌株與野生型菌株相比，菌絲生長速度減慢，產(chǎn)分生孢子量減少，表明UvZC1基因參與了稻曲病病菌生長和產(chǎn)分生孢子過程。真菌產(chǎn)分生孢子是多基因參與的過程，在稻曲病病菌中，已有報(bào)道顯示，編碼腺苷酸環(huán)化酶（UvAc1）、蛋白激酶（UvSLT2和UvCDC2）、轉(zhuǎn)錄因子（UvCOM1和UvHOG1）、效應(yīng)因子（UvBI-1）等蛋白質(zhì)的基因敲除均導(dǎo)致稻曲病病菌的產(chǎn)分生孢子量下降[7-8，13-14，16]。本研究發(fā)現(xiàn)，UvZC1基因正調(diào)控基因UvAc1和UvSLT2的表達(dá)，負(fù)調(diào)控基因UvCDC2、UvCom1和UvHog1的表達(dá)，可見稻曲病病菌產(chǎn)分生孢子也是多基因參與的過程，UvZC1作為轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)節(jié)多個(gè)稻曲病病菌產(chǎn)分生孢子相關(guān)基因的表達(dá)。此外，UvZC1基因敲除突變體菌株對(duì)由NaCl、KCl和Sorbitol等引起的鹽脅迫和滲透壓脅迫的響應(yīng)與野生型沒有顯著差異，表明UvZC1不參與調(diào)節(jié)稻曲病病菌對(duì)鹽脅迫和滲透壓脅迫的響應(yīng)[11]。剛果紅通過阻止細(xì)胞壁葡聚糖鏈之間的橫向作用來影響細(xì)胞壁的完整性，而SDS能使細(xì)胞壁變脆弱，從而裂解細(xì)胞。UvZC1基因敲除突變體菌株對(duì)SDS的耐受性降低，表明UvZC1參與調(diào)控稻曲病病菌細(xì)胞壁的完整性，但不影響稻曲病病菌細(xì)胞壁葡聚糖鏈之間的互作。

病原菌侵染寄主植物時(shí)會(huì)誘導(dǎo)其產(chǎn)生一系列防衛(wèi)反應(yīng)來抵御病原菌的侵染[25-26]，活性氧是侵染早期寄主的重要防衛(wèi)反應(yīng)物質(zhì)之一[27]。本研究中，H2O2可以誘導(dǎo)稻曲病病菌UvZC1基因的表達(dá)，同時(shí)UvZC1敲除突變體菌株對(duì)H2O2的耐受性較野生型增強(qiáng)，表明UvZC1蛋白參與稻曲病病菌響應(yīng)氧化脅迫的過程。通過檢測侵染階段UvZC1基因的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，UvZC1基因表達(dá)量在接種后24 h和48 h即侵染早期顯著上升。然而Jt209、UvZC1敲除突變體菌株和回補(bǔ)菌株在水稻上產(chǎn)生的稻曲球數(shù)量和形態(tài)沒有明顯差異，說明該基因不影響稻曲病病菌稻曲球的產(chǎn)生。可能由于從稻曲病病菌基因組中已經(jīng)預(yù)測到90多個(gè)C6轉(zhuǎn)錄因子[1]，它們之間存在功能冗余現(xiàn)象，即在UvZC1缺失時(shí)，稻曲病病菌的其他C6轉(zhuǎn)錄因子基因能夠部分替代UvZC1行使功能，導(dǎo)致最終表現(xiàn)為致病力無明顯改變[28-29]。綜上所述，UvZC1參與了稻曲病病菌生長、分生孢子產(chǎn)生、響應(yīng)氧化脅迫和細(xì)胞壁完整性建成、侵染水稻等過程，這對(duì)認(rèn)識(shí)稻曲病病菌Zn（Ⅱ）2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子功能具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]SUN W X， FAN J， FANG A F， et al. Ustilaginoidea virens： insights into an emerging rice pathogen[J]. Annual Review of Phytopathology， 2020， 58： 363-385.

[2]FAN J， YANG J， WANG Y Q， et al. Current understanding on Villosiclava virens， a unique flower-infecting fungus causing rice false smut disease[J]. Molecular Plant Pathology， 2016， 17（9）： 1321-1330.

[3]李小娟，劉二明，肖啟明，等. 水稻對(duì)稻曲病抗性的分級(jí)及相應(yīng)級(jí)別的產(chǎn)量損失[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2011， 37（3）：275-279.

[4]MENG J J， GU G， DANG P Q， et al. Sorbicillinoids from the fungus Ustilaginoidea virens and their phytotoxic， cytotoxic， and antimicrobial activities[J]. Frontiers in Chemistry， 2019， 7： 435.

[5]LI Y J， WANG M， LIU Z H， et al. Towards understanding the biosynthetic pathway for ustilaginoidin mycotoxins in Ustilaginoidea virens[J]. Environmental Microbiology， 2019， 21（8）： 2629-2643.

[6]YU J J， YU M N， SONG T Q， et al. A homeobox transcription factor UvHOX2 regulates chlamydospore formation， conidiogenesis， and pathogenicity in Ustilaginoidea virens[J]. Frontiers in Microbiology， 2019， 10： 1071.

[7]CHEN X， HAI D， TANG J， et al. UvCom1 is an important regulator required for development and infection in the rice false smut fungus Ustilaginoidea virens[J]. Phytopathology， 2020， 110（2）： 483-493.

[8]ZHENG D W， WANG Y， HAN Y， et al. UvHOG1 is important for hyphal growth and stress responses in the rice false smut fungus Ustilaginoidea virens[J]. Scientific Reports， 2016， 6： 24824.

[9]MACPHERSON S， LAROCHELLE M， TURCOTTE B. A fungal family of transcriptional regulators： the zinc cluster proteins[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews， 2006， 70（3）：583-604.

[10]ZHANG Y， ZHANG K， FANG A， et al. Specific adaptation of Ustilaginoidea virens in occupying host florets revealed by comparative and functional genomics[J]. Nature Communications， 2014， 5： 3849.

[11]YU M N， YU J J， HU J K， et al. Identification of pathogenicity-related genes in the rice pathogen Ustilaginoidea virens through random insertional mutagenesis[J]. Fungal Genetics and Biology， 2015， 76： 10-19.

[12]張君成，陳志誼，張炳欣，等. 稻曲病的接種技術(shù)研究[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 2004， 34（5）： 463-467.

[13]LIANG Y F， HAN Y， WANG C F， et al. Targeted deletion of the USTA and UvSLT2 genes efficiently in Ustilaginoidea virens with the CRISPR-Cas9 system[J]. Frontiers in Plant Science， 2018， 9： 699.

[14]GUO W W， GAO Y X， YU Z M， et al. The adenylate cyclase UvAc1 and phosphodiesterase UvPdeH control the intracellular cAMP level， development， and pathogenicity of the rice false smut fungus Ustilaginoidea virens[J]. Fungal Genetics and Biology， 2019， 129： 65-73.

[15]TANG J T， BAI J， CHEN X Y， et al. Two protein kinases UvPmk1 and UvCDC2 with significant functions in conidiation， stress response and pathogenicity of rice false smut fungus Ustilaginoidea virens[J]. Current Genetics， 2020， 66（10）： 409-420.

[16]XIE S L， WANG Y F， WEI W， et al. The Bax inhibitor UvBI-1， a negative regulator of mycelial growth and conidiation， mediates stress response and is critical for pathogenicity of the rice false smut fungus Ustilaginoidea virens[J]. Current Genetics， 2019， 65（5）： 1185-1197.

[17]GOLDAR M M， JEONG H T， TANAKA K， et al. Moc3， a novel Zn finger type protein involved in sexual development， ascus formation， and stress response of Schizosaccharomyces pombe[J]. Current Genetics， 2005， 48（6）： 345-355.

[18]CAMPBELL R N， LEVERNTZ M K， RYAN L A， et al. Metabolic control of transcription： paradigms and lessons from Schizosaccharomyces cerevisiae[J]. Biochemical Journal， 2008， 414（2）： 177-187.

[19]LU J P， CAO H J， ZHANG L L， et al. Systematic analysis of Zn2Cys6 transcription factors required for development and pathogenicity by high-throughput gene knockout in the rice blast fungus[J]. PLoS Pathogens， 2014， 10（10）： e1004432.

[20]HAGIWARA D， MIURA D， SHIMIZU K， et al. A novel Zn2Cys6 transcription factor AtrR plays a key role in an azole resistance mechanism of Aspergillus fumigatus by co-regulating cyp51A and cdr1B expressions[J]. PLoS Pathogens， 2016， 13（1）： e1006096.

[21]SON H， SEO Y S， MIN K， et al. A phenome-based functional analysis of transcription factors in the cereal head blight fungus Fusarium graminearum[J]. PLoS Pathogens， 2011， 7（10）： e1002310.

[22]LONG N B， ORASCH T， ZHANG S Z， et al. The Zn2Cys6-type transcription factor LeuB cross-links regulation of leucine biosynthesis and iron acquisition in Aspergillus fumigatus[J]. PLoS Genetics， 2018， 14（10）： e1007762.

[23]ZHAO C Z， WAALWIJK C， DE WIT P J G M， et al. EBR1， a novel Zn2Cys6 transcription factor， affects virulence and apical dominance of the hyphal tip in Fusarium graminearum[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2011， 24（12）：1407-1418.

[24]GARG A， GOLDGUR Y， SCHWER B， et al. Distinctive structural basis for DNA recognition by the fission yeast Zn2Cys6 transcription factor Pho7 and its role in phosphate homeostasis[J]. Nucleic Acids Research， 2018， 46（21）： 11262-11273.

[25]羅麗芬，江冰冰，鄧琳梅，等. 三七根系分泌物中幾種成分對(duì)根腐病原菌生長的影響[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2020，51（12）：2952-2961.

[26]劉一賢，蔡志英，施玉萍，等. 辣木果腐病病原菌蘭生炭疽菌（Colletotrichum chlorophyti）生物學(xué)特性及其防治藥劑室內(nèi)毒力測定[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（20）：133-137.

[27]RHEE S G. H2O2， a necessary evil for cell signaling[J]. Science， 2006， 312（5782）： 1882-1883.

[28]WAGNER A. Genetic redundancy caused by gene duplications and its evolution in networks of transcriptional regulators [J]. Biological Cybernetics， 1996， 74（6）：557-567.

[29]WAGNER A. Redundant gene functions and natural selection[J]. Journal of Evolutionary Biology， 1999， 12（1）：2646-2658.

（責(zé)任編輯：徐艷）

收稿日期：2021-02-18

基金項(xiàng)目：江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK20180296）;國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31401700）

作者簡介：俞咪娜（1985-），女，浙江杭州人，碩士，副研究員，主要研究方向?yàn)樗菊婢『χ虏C(jī)制等。（E-mail）zjpsyu@163.com

通訊作者：劉永鋒，（E-mail）liuyf@jaas.ac.cn