高若珊，王 冰，范洪臣，石彥國(guó)，朱秀清，呂銘守

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院/黑龍江省普通高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江省谷物食品與谷物資源綜合加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150076)

豆腐是中國(guó)的特產(chǎn)，歷史悠久。據(jù)《本草綱目》記載：“豆腐之法，始于淮南王劉安”。相傳，在2000多年前，在安徽淮南境內(nèi)，西漢淮南王劉安煉丹時(shí)的一次失誤，讓瑩白細(xì)膩、鮮嫩綿滑的豆腐意外誕生。不同于鹵水豆腐、內(nèi)酯豆腐，酸漿豆腐是用豆腐漿水經(jīng)乳酸菌發(fā)酵而成的酸漿點(diǎn)成的豆腐。酸漿豆腐以其滑嫩的口感、濃郁的豆香、獨(dú)特的制作工藝等特點(diǎn)，入選了我國(guó)山東省非物質(zhì)文化遺產(chǎn)名錄。

酸漿是豆腐黃漿水在自然環(huán)境中發(fā)酵而成的，以乳酸菌為主要菌群。豆腐點(diǎn)漿需要在75 ℃以上的高溫進(jìn)行，普通乳酸菌無(wú)法耐受此溫度會(huì)大量失活。如果能研究出耐高溫的乳酸菌，使豆腐在后熟階段依然保持較高的菌活性，通過(guò)乳酸菌自然代謝的產(chǎn)物分解蛋白質(zhì)，從而改變蛋白質(zhì)凝膠結(jié)構(gòu)，可達(dá)到提高豆腐品質(zhì)的目的且可以改良豆腐的風(fēng)味[1-3]。

近年來(lái)，人們對(duì)乳酸菌的耐溫性進(jìn)行了大量探究，已有人運(yùn)用紫外誘變、激光誘變、化學(xué)試劑誘變和常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)誘變等技術(shù)選育出遺傳性能穩(wěn)定、產(chǎn)酸量高的菌株。有研究運(yùn)用紫外誘變的方法得到了更耐高溫且產(chǎn)酸性能好的菌株[4-6]。然而，迄今為止的研究成果中獲得的乳酸菌，均未達(dá)到可耐75 ℃以上高溫的特性。發(fā)酵工業(yè)及眾多食品加工過(guò)程在操作時(shí)無(wú)法避免高溫，因此選育耐高溫菌株[7-8]具有重要的理論意義和廣闊的應(yīng)用前景。本研究以課題組前期自云南建水酸漿豆腐中分離的菌株為出發(fā)菌株，通過(guò)紫外誘變的方法篩選耐高溫菌株，對(duì)其產(chǎn)酸性能及耐熱性進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1實(shí)驗(yàn)菌種

誘變出發(fā)菌株為4株本課題組前期保存菌株(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院糧油學(xué)科實(shí)驗(yàn)室保藏)，編號(hào)為HCUL 1.1801-1912(誘變后菌株的CGMCC保藏編號(hào)為19309)、HCUL 1.1802-1912、HCUL 1.1706-1912、HCUL 1.1707-1912。

1.1.2培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母粉4.0 g，牛肉粉5.0 g，葡萄糖20.0 g，乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，吐溫80 1 mL，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.5 g，蒸餾水1 000 mL。121 ℃滅菌20 min。

MRS固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5 %的瓊脂粉。121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

直管-20W型紫外燈，江蘇巨光光電科技有限公司；DHP-9052型培養(yǎng)箱，上海合恒儀器設(shè)備有限公司；HWS型水浴鍋，紹興萬(wàn)力儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1菌種的活化

分別從凍藏的HCUL 1.1801-1912、HCUL 1.1802-1912、HCUL 1.1706-1912、HCUL 1.1707-1912原菌株保藏管中蘸取一環(huán)菌液,劃線涂布于MRS固體培養(yǎng)基。37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后,挑取培養(yǎng)基上的單菌落接種于MRS 液體培養(yǎng)基，37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h，得到活化二代的種子液，備用。

1.3.2生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

通過(guò)測(cè)定4株原菌液的生長(zhǎng)曲線,確定適宜的培養(yǎng)時(shí)間和紫外誘變時(shí)間。種子液以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的接種量接入到MRS液體培養(yǎng)基中，250 mL三角瓶中裝液量為100 mL。37 ℃靜置培養(yǎng)，每隔2 h取樣，采用比濁法，測(cè)定4株原菌的OD600值,繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.3紫外誘變

分別將4株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中后期的原菌液離心收集,用生理鹽水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的NaCl水溶液)洗滌2次后,稀釋成OD600值在0.6～0.8的菌懸液備用，開啟紫外燈，在燈預(yù)熱20 min后，將菌懸液滴加在培養(yǎng)皿中直至完全浸沒培養(yǎng)皿且菌懸液高約1 mm，放置于20 W紫外燈下0、20、25、30、35 cm處，用磁力攪拌器，在攪拌狀態(tài)下分別照射0、10、20、30、40、50、60 s。

1.3.4致死率計(jì)算

將經(jīng)過(guò)誘變處理后的菌懸液按10倍梯度稀釋6次，分別記為10-1～10-6。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)各個(gè)稀釋梯度進(jìn)行計(jì)數(shù)，得出稀釋10-4、10-5、10-6時(shí)計(jì)數(shù)效果較好。正式實(shí)驗(yàn)時(shí)將10-4、10-5、10-6的稀釋菌懸液涂布在MRS固體培養(yǎng)基上,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,每個(gè)梯度做3組平行實(shí)驗(yàn),未經(jīng)誘變的菌懸液作對(duì)照組，在相同條件下培養(yǎng)，進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。通過(guò)平板菌落數(shù)來(lái)計(jì)算誘變致死率[9-10],并獲得致死率曲線。

1.3.5耐高溫篩選

將紫外誘變得到的突變株接種于MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，轉(zhuǎn)移至60 ℃水浴鍋中培養(yǎng)30 min，再轉(zhuǎn)接至MRS液體培養(yǎng)基，同時(shí)平板計(jì)數(shù)其存活率。在60 ℃水浴30 min條件下反復(fù)傳代5代，并篩選連續(xù)2～3代的存活率達(dá)90%以上的菌株，再繼續(xù)提高水浴溫度至75 ℃，以此循環(huán)逐漸提高水浴溫度對(duì)菌株進(jìn)行梯度耐高溫篩選[11-12]。

1.3.6菌株富集培養(yǎng)

將紫外誘變得到的耐高溫突變株富集培養(yǎng)。取1 mL菌液，加入9 mL的無(wú)菌水，得到稀釋10倍的菌液，然后以稀釋10倍的菌液為母液建立稀釋100倍的菌液。重復(fù)上述步驟，直到得到稀釋6個(gè)梯度倍數(shù)。用MRS培養(yǎng)基分別將上述6個(gè)梯度的菌株在無(wú)菌條件下培養(yǎng)，分別記為1號(hào)，2號(hào)，3號(hào)，4號(hào)，5號(hào)，6號(hào)。37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察鏡檢，選用最適合的菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，測(cè)OD600值。重復(fù)上述操作連續(xù)傳代5次以上，得到富集培養(yǎng)[13]后活性好的菌株。

1.3.7產(chǎn)酸量測(cè)定

將5 mL待測(cè)液放入250 mL的錐形瓶中用排CO2后的蒸餾水稀釋適當(dāng)倍數(shù)，滴3滴酚酞指示液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%)并搖勻，用0.1 mol/L NaOH的標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)試液進(jìn)行滴定，滴定終點(diǎn)為微紅色且30 s不褪色，記錄消耗標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液的體積并計(jì)算其總產(chǎn)酸量[14-16]。

(1)

式(1)中，c2為產(chǎn)酸量，mol/L；c1為標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液濃度，mol/L；F為試液稀釋倍數(shù)；V1為滴定發(fā)酵液所消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V2為滴定空白對(duì)照組所消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V3為待測(cè)發(fā)酵液體積，mL。

1.3.8不同階段菌株編號(hào)

將經(jīng)過(guò)紫外誘變處理后未耐高溫前篩選的菌株分別編號(hào)為：HCUL 1.1801-1912Y、HCUL 1.1802-1912Y、HCUL 1.1706-1912Y、HCUL 1.1707-1912Y；將經(jīng)過(guò)紫外誘變處理后且經(jīng)過(guò)高溫溫度梯度篩選的菌株分別編號(hào)為：HCUL 1.1801-1912X、HCUL 1.1802-1912X、HCUL 1.1706-1912X、HCUL 1.1707-1912X；將經(jīng)過(guò)紫外耐高溫選育后富集培養(yǎng)的菌株分別編號(hào)為：HCUL 1.1801-1912Z、HCUL 1.1802-1912Z、HCUL 1.1706-1912Z、HCUL 1.1707-1912Z。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Origin Pro 2019軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)時(shí)間的確定

測(cè)定HCUL 1.1801-1912、HCUL 1.1802-1912、HCUL 1.1706-1912、HCUL 1.1707-1912 4株菌的生長(zhǎng)曲線見圖1。

圖1 4株原菌生長(zhǎng)曲線

由圖1可知，培養(yǎng)3 h后,菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)期；培養(yǎng)12 h后，菌體進(jìn)入穩(wěn)定期。由于在對(duì)數(shù)期，菌體生長(zhǎng)代謝旺盛，適合正向突變，所以選取培養(yǎng)至第8 h的培養(yǎng)液進(jìn)行紫外誘變。

2.2 紫外誘變適宜照射條件的確定

紫外誘變對(duì)菌株致死率的影響研究結(jié)果見圖2。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，選取30 s為紫外照射時(shí)間，在照射強(qiáng)度為20 W的紫外光下，改變紫外照射距離，根據(jù)菌株的致死率繪制致死率曲線，見圖2(a)。選取30 cm為紫外照射距離，在照射強(qiáng)度為20 W的紫外光下，改變紫外照射時(shí)間，見圖2(b)。

圖2 紫外誘變對(duì)菌株致死率的影響

由圖2(a)可知，隨著照射距離增加致死率減小，在紫外距離30 cm時(shí)，菌株的致死率為75.99%；由圖2(b)可知，隨著照射時(shí)間增加致死率增大，在紫外照射時(shí)間30 s時(shí)，菌株的致死率為83.79%。近年研究發(fā)現(xiàn)，稍低的誘變劑量有利于正向突變，一般采用75%～85%致死率的劑量[17-18]。故取紫外距離30 cm、紫外照射時(shí)間30 s為紫外誘變條件。

2.3 突變菌株耐高溫篩選結(jié)果

為確定篩選的菌株是突變菌株，將4株原菌在75 ℃水浴鍋下進(jìn)行水浴，見圖3。隨著水浴時(shí)間的增加，菌株的致死率增加，4株原菌都無(wú)法在75 ℃高溫下耐受超過(guò)10 min。

圖3 4株原菌在75 ℃水浴下致死率

篩選生長(zhǎng)速度最快，菌液濃度最高、pH值最低的菌株，分別命名為HCUL 1.1801-1912Y、HCUL 1.1802-1912Y、HCUL 1.1706-1912Y、HCUL 1.1707-1912Y，培養(yǎng)24 h測(cè)得的OD600見圖4。由于酸漿豆腐在75 ℃高溫下點(diǎn)漿、蹲腦過(guò)程需持續(xù)20～30 min，因此以30 min為高溫處理時(shí)間，將菌株HCUL 1.1801-1912Y、HCUL 1.1802-1912Y、HCUL 1.1706-1912Y、HCUL 1.1707-1912Y其依次在60、65、70、75 ℃水浴鍋中水浴30 min進(jìn)行耐高溫篩選，最終分別獲得可在75 ℃下耐受30 min并生長(zhǎng)的菌株，命名為HCUL 1.1801-1912X、HCUL 1.1802-1912X、HCUL 1.1706-1912X、HCUL 1.1707-1912X，培養(yǎng)24 h測(cè)得的OD600見圖4。

圖4 4株菌耐高溫前后生長(zhǎng)曲線對(duì)比

由圖4可知，HCUL 1.1801-1912Y在培養(yǎng)12 h時(shí)到達(dá)峰值OD600值為2.015，HCUL 1.1801-1912X在培養(yǎng)12 h時(shí)到達(dá)峰值為1.655，培養(yǎng)24 h后對(duì)比，HCUL 1.1801-1912Y耐高溫后OD600值下降0.360；1.1802-1912Y在培養(yǎng)12 h時(shí)到達(dá)峰值OD600值為1.975，HCUL 1.1802-1912X在培養(yǎng)12 h時(shí)到達(dá)峰值為1.617，培養(yǎng)24 h后對(duì)比，HCUL 1.1801-1912Y耐高溫后OD600值下降0.358；HCUL 1.1706-1912Y在培養(yǎng)12 h時(shí)到達(dá)峰值OD600值為1.960，HCUL 1.1706-1912X在培養(yǎng)12 h時(shí)到達(dá)峰值為1.516，培養(yǎng)24 h后對(duì)比，HCUL 1.1801-1912Y耐高溫后OD600值下降0.444；HCUL 1.1707-1912Y在培養(yǎng)12 h時(shí)到達(dá)峰值OD600值為1.960，HCUL 1.1707-1912X在培養(yǎng)12 h時(shí)到達(dá)峰值為1.749，培養(yǎng)24 h后對(duì)比，HCUL 1.1707-1912Y耐高溫后OD600值下降0.211。由此對(duì)比可知，耐高溫后4株菌活力均有所下降，HCUL 1.1801-1912Y菌活力下降最多，HCUL 1.1707-1912Y菌活力下降最少，耐高溫前1.1801-1912Y的菌活力最好，耐高溫后HCUL 1.1707-1912X的菌活力最好，為進(jìn)一步探討4株菌的生長(zhǎng)情況，提高菌活性，對(duì)菌株進(jìn)行富集培養(yǎng)。

2.4 突變菌株富集培養(yǎng)結(jié)果

由于豆腐點(diǎn)漿溫度在75 ℃以上，且經(jīng)過(guò)較低溫梯度60、65、70、75 ℃，耐高溫30 min一次實(shí)驗(yàn)后，為避免實(shí)驗(yàn)偶然性，再分別進(jìn)行溫度梯度耐高溫30 min兩次，觀察菌種生長(zhǎng)情況，最終得到經(jīng)75 ℃耐高溫30 min三次，篩選出的菌株仍生長(zhǎng)且長(zhǎng)勢(shì)較優(yōu)。經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn)4株菌耐高溫后其生長(zhǎng)活力均有所降低，為得到活力較好的菌株，將耐高溫后的菌株分別進(jìn)行富集培養(yǎng)，并命名為HCUL 1.1801-1912Z、HCUL 1.1802-1912Z、HCUL 1.1706-1912Z、HCUL 1.1707-1912Z，其生長(zhǎng)曲線如圖5。

圖5 4株菌富集培養(yǎng)后生長(zhǎng)曲線對(duì)比

由圖5可知，HCUL 1.1801-1912Z培養(yǎng)12 h時(shí)達(dá)到峰值OD600為1.915，培養(yǎng)24 h后OD600為1.775；HCUL 1.1802-1912Z的OD600最大為1.906培養(yǎng)24 h后OD600為1.775；HCUL 1.1706-1912Z整體活力在4株菌中最弱，但較富集前有所提高，OD600最大為1.617培養(yǎng)24 h后OD600為1.434；HCUL 1.1707-1912Z最早到達(dá)峰值，OD600最大為1.774培養(yǎng)24 h后OD600為1.559。對(duì)比圖4可得培養(yǎng)24 h后，HCUL 1.1801-1912Z比富集培養(yǎng)前OD600提高了0.277；HCUL 1.1802-1912Z比富集培養(yǎng)前OD600提高了0.329；HCUL 1.1706-1912Z比富集培養(yǎng)前OD600提高了0.094；HCUL 1.1707-1912Z比富集培養(yǎng)前OD600提高了0.010。HCUL 1.1802-1912Z經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)后菌活力提高最為顯著，HCUL 1.1801-1912Z菌活力雖然提高沒有HCUL 1.1802-1912Z多，但在4株菌里菌活性最高，且生長(zhǎng)曲線穩(wěn)定。

2.5 菌株在不同階段的產(chǎn)酸能力比較

分別測(cè)定4株菌在3個(gè)不同階段(紫外誘變處理前、紫外誘變處理后耐高溫篩選前、紫外誘變耐高溫篩選后)培養(yǎng)48 h的產(chǎn)酸量，每隔4 h測(cè)定產(chǎn)酸量如圖6。

圖6 4株菌不同階段產(chǎn)酸情況對(duì)比

產(chǎn)酸量是乳酸菌發(fā)酵酸漿的重要指標(biāo)，產(chǎn)酸好的酸漿可制備更優(yōu)質(zhì)的酸漿豆腐。結(jié)合圖6可知在3個(gè)不同階段4株菌培養(yǎng)48 h內(nèi)產(chǎn)酸量均隨時(shí)間增加而增多。在發(fā)酵初期的24 h內(nèi)，菌株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，產(chǎn)酸能力強(qiáng)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)酸速率有所下降，48 h后產(chǎn)酸量趨于平穩(wěn)。誘變耐高溫后篩選的4株菌產(chǎn)酸量均較原菌株顯著提高，富集培養(yǎng)后產(chǎn)酸量均有所增加。其中培養(yǎng)48 h后，HCUL 1.1801-1912的產(chǎn)酸量為26.01 g/L，HCUL 1.1801-1912Y的產(chǎn)酸量為45.72 g/L，HCUL 1.1801-1912Z的產(chǎn)酸量為57.06 g/L，HCUL 1.1801-1912Z比原菌種產(chǎn)酸量提高了31.05 g/L是4株菌中產(chǎn)酸量最高的。高的產(chǎn)酸量使發(fā)酵液的pH值降低，對(duì)于酸漿來(lái)說(shuō)pH的下降可抑制其他微生物的生長(zhǎng)，對(duì)酸漿的安全性具有重要意義。由此選擇菌株HCUL 1.1801-1912Z作為這4株菌中的最優(yōu)菌。

3 結(jié) 論

通過(guò)紫外誘變方法對(duì)4株目標(biāo)菌進(jìn)行誘變，紫外誘變條件為紫外照射強(qiáng)度20 W、照射距離30 cm、照射時(shí)間30 s。用耐高溫溫度梯度的方法篩選獲得4株耐75 ℃高溫30 min的菌，溫度梯度誘變是一種有效的育種技術(shù)，具有方向性好和遺傳性穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。高溫誘變后的菌株活力、產(chǎn)酸均較之前有所降低，將其培養(yǎng)富集，得到可在75 ℃高溫30 min的條件下依然保持較好的活力和產(chǎn)酸能力的菌。乳酸菌在自然代謝過(guò)程中產(chǎn)生有機(jī)酸、蛋白酶等產(chǎn)物[19-20]，在豆腐后熟階段能繼續(xù)水解脂肪和蛋白質(zhì)。乳酸菌發(fā)酵降解脂肪為游離脂肪酸，在乳酸菌蛋白酶的作用下大分子蛋白質(zhì)降解為小分子肽和必需氨基酸，改變蛋白質(zhì)的凝膠結(jié)構(gòu), 從而達(dá)到改變產(chǎn)品品質(zhì)的目的。因此誘變耐高溫的菌株應(yīng)用于酸漿豆腐當(dāng)中，將大大提高豆腐后熟階段中的菌活性。通過(guò)乳酸菌自然發(fā)酵的代謝產(chǎn)物對(duì)酸漿豆腐蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行改變，可得到品質(zhì)更好的酸漿豆腐，為酸漿豆腐制作提供更優(yōu)的生物材料。由于傳統(tǒng)的酸漿豆腐工藝多為小作坊、家庭式工藝，豆腐品質(zhì)往往因?yàn)椴煌牡乩憝h(huán)境、生活環(huán)境、季節(jié)變化等因素產(chǎn)生較大差異，想要更好進(jìn)行酸漿豆腐工業(yè)化生產(chǎn)的推廣，就需要培育出更優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)定的菌株來(lái)發(fā)酵酸漿。因此，耐高溫的乳酸菌可以為豆腐酸漿的發(fā)酵提供優(yōu)質(zhì)菌種，更有利于酸漿豆腐的工業(yè)化生產(chǎn)。乳酸菌是研究分類、生化、遺傳、分子生物學(xué)和基因工程的理想材料(在理論上具有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值)，其通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸、特殊酶系、酸菌素等物質(zhì)具有特殊生理功能。豆腐酸漿水[21]中主要包括乳酸菌、醋酸菌、酵母菌等菌種，其中乳酸菌為主要菌種[22-23]。本研究通過(guò)紫外誘變、不同溫度梯度篩選出耐高溫且高產(chǎn)酸的乳酸菌，更適用于酸漿豆腐的制作工藝[24]，可在豆腐點(diǎn)漿后保持較高的菌活性，在豆腐后熟階段更好發(fā)揮作用，提高豆腐質(zhì)構(gòu)。本研究通過(guò)紫外誘變和溫度梯度篩選手段獲得4株耐高溫且產(chǎn)酸好的突變株，其中HCUL 1.1801-1912Z的效果最優(yōu)，是4株突變菌中單位時(shí)間生長(zhǎng)最快、產(chǎn)酸能力最強(qiáng)的菌，為發(fā)酵酸漿、制作酸漿豆腐提供了更優(yōu)選擇。