黃建棋 郭文利 范偉民 陸建菊 陸 凱

乳腺癌起源于乳腺上皮組織，是女性發(fā)生率最高的惡性腫瘤之一[1]。乳腺癌的發(fā)生率逐年上升且日趨年輕化[2]。盡管乳腺癌的治療手段得到很大發(fā)展，過度增殖和轉(zhuǎn)移仍是影響患者預(yù)后的主要因素[3]。因此，探究乳腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移機(jī)制對尋找新的分子治療靶點(diǎn)具有重要臨床意義。微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性、非編碼、單鏈小分子RNA，負(fù)責(zé)調(diào)控人類基因組內(nèi)30%基因的表達(dá)，對細(xì)胞遷移、侵襲、增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程至關(guān)重要[4, 5]。miRNA直接參與人類腫瘤如淋巴癌、甲狀腺癌、鼻咽癌、乳腺癌等的發(fā)生和發(fā)展，與腫瘤的直徑、臨床分期、化療敏感度、放療敏感度等密切相關(guān)，miRNA可能成為腫瘤的生物學(xué)標(biāo)志物和分子治療靶點(diǎn)[6,7]。miR-4715-5p是一個新近報道的miRNA，可有效抑制肺癌的生長和轉(zhuǎn)移，發(fā)揮抑癌基因功能[8]。然而，miR-4715-5p在乳腺癌中的表達(dá)、功能和分子機(jī)制尚不明確。本研究旨在觀察miR-4715-5p在乳腺癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平，分析高表達(dá)miR-4715-5p對乳腺癌細(xì)胞遷移和增殖的影響，探討miR-4715-5p在乳腺癌細(xì)胞中的分子機(jī)制，為乳腺癌的分子靶向治療提供新的思路。

材料與方法

1.組織標(biāo)本：43例乳腺癌組織和癌旁組織來自2017年8月～2019年12月于筆者醫(yī)院乳腺病科經(jīng)手術(shù)切除治療的患者?；颊咂骄挲g為51.59±7.46歲；高分化 22例、中分化 16例、低分化5例；TNM 分期Ⅰ期 26 例、Ⅱ期13例、Ⅲ期4例；腫瘤直徑≤3cm 18例，>3cm 25例。所有組織標(biāo)本均經(jīng)兩名以上病理學(xué)專家確診，組織置于液氮中冷凍保存。本研究由筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)。

2.細(xì)胞系和主要試劑：正常乳腺細(xì)胞系(MCF-10A)和乳腺癌細(xì)胞系(HCC1937、MCF-7、MB-MDA-468、SKBR3)均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司。胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。對照模擬物NC、miR-4715-5p模擬物(5′-AAGUUGGCUGCA-GUUAAGGUGG-3′)、MUC1 mRNA野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒購自上海吉瑪生物工程公司。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司。qRT-PCR試劑盒購自美國Applied Biosystems公司。CCK-8試劑盒購自上海拜力生物科技有限公司?？功?actin、MUC1、p-PI3K、p-AKT、p-PDK1、MDM2抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司。

3.細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：采用含10% FBS、青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MCF-10A和MB-MDA-468細(xì)胞，采用含10% FBS、青霉素和鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HCC1937、MCF-7、SKBR3細(xì)胞，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞接種于6孔板，分別將2μl Lipofectamine 3000與5nmol NC模擬物或miR-4715-5p以體積比1∶50均勻混合，冰上靜止15min，緩慢加入6孔板，搖晃均勻后繼續(xù)培養(yǎng)，分別命名為對照組和實(shí)驗(yàn)組。轉(zhuǎn)染48h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

4.RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)：采用Trizol法提取乳腺癌組織和細(xì)胞系總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。配置qRT-PCR反應(yīng)體系20μl，設(shè)定反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性5min；62℃ 35s，70℃ 35s，共35個循環(huán)。以U6為內(nèi)參檢測miR-4715-5p的表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)參檢測MUC1 mRNA的表達(dá)水平。引物由上海生工生物科技服務(wù)有限公司合成，β-actin上游引物：5′-GGCACCACACCTTCTACAAT-3′，下游引物：5′-GCCTGGATAGCAACGTACAT-3′。miR-4715-5p上游引物： 5′-AAGTTGGCTGCAGTTAAGGTGG-3′，下游引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGT-3′。U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。MUC1上游引物： 5′-TGCCGCCGAAAGAACTACG-3′，下游引物：5′-TGGGGTACTCGCTCATAGGAT-3′。

5.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：收集對數(shù)生長期的兩組MCF-7細(xì)胞，采用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基制成密度為5×105個/毫升的單細(xì)胞懸液，以2毫升/孔接種至6孔板，待細(xì)胞貼壁后，采用200μl無菌槍頭在6孔板底部劃痕，采用PBS溶液洗3次，加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，倒置顯微鏡下觀察并拍照，記錄劃痕面積S1。繼續(xù)培養(yǎng) 24h，倒置顯微鏡下觀察并拍照，記錄劃痕面積S2。細(xì)胞遷移率(%)= (S1-S2)/S1×100%。

6.CCK-8法：收集對數(shù)生長期的兩組MCF-7細(xì)胞，以5×103個/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200μl，在培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)1、2、3、4、5天，每孔加入30μl CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。采用酶標(biāo)儀記錄在450nm波長下各孔的吸光度(A)值，繪制兩組MCF-7細(xì)胞的生長曲線。

7.生物信息學(xué)軟件預(yù)測和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)：采用miRNAMap、miRWalk、PicTar軟件預(yù)測miR-4715-5p可互補(bǔ)結(jié)合的靶基因。收集對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組：共轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒+NC、共轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒+miR-4715-5p、共轉(zhuǎn)染突變型質(zhì)粒+NC、共轉(zhuǎn)染突變型質(zhì)粒+miR-4715-5p。24h后分別檢測每孔螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性。相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

8.Western blot法：收集對數(shù)生長期的兩組MCF-7細(xì)胞，在冰上提取細(xì)胞總蛋白。配制10%十二烷基苯磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，上樣后電泳110min。采用硝酸纖維素膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，于5%脫脂牛奶中封閉。配制一抗，稀釋比例：β-actin(1∶2000)、MUC1(1∶1000)、p-PI3K(1∶2000)、p-AKT(1∶2000)、p-PDK1(1∶1000)、MDM2(1∶2000)，在4℃冰箱中孵育過夜。配制二抗，在室溫下孵育3h。滴加ECL顯影液，在凝膠成像系統(tǒng)下成像，以β-actin為內(nèi)參。

結(jié) 果

1.miR-4715-5p在乳腺癌組織和乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平：miR-4715-5p在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)分別為0.91±0.38和4.89±0.64，miR-4715-5p在乳腺癌組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織(P<0.01，圖1)。miR-4715-5p在正常乳腺細(xì)胞系(MCF-10A)和乳腺癌細(xì)胞系(HCC1937、MCF-7、MB-MDA-468、SKBR3)中的表達(dá)分別為1.01±0.08、0.76±0.06、0.13±0.03、0.50±0.05、0.38±0.08，miR-4715-5p在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著低于正常乳腺細(xì)胞系(P均<0.05)，MCF-7細(xì)胞中miR-4715-5p的表達(dá)水平最低(P<0.01，圖2)。

圖1 乳腺癌組織和癌旁組織中 miR-4715-5p的表達(dá)水平

圖2 乳腺癌細(xì)胞系和正常乳腺細(xì)胞系中 miR-4715-5p的表達(dá)水平 與MCF-10A細(xì)胞系比較，*P<0.05，**P<0.01

2.各組MCF-7細(xì)胞miR-4715-5p的表達(dá)水平：對照組和實(shí)驗(yàn)組MCF-7細(xì)胞中miR-4715-5p的表達(dá)分別為1.13±0.30和9.98±1.10，實(shí)驗(yàn)組miR-4715-5p的表達(dá)水平顯著高于對照組(P<0.01)，表明miR-4715-5p模擬物在MCF-7細(xì)胞中成功高表達(dá)。

3.高表達(dá)miR-4715-5p抑制MCF-7細(xì)胞的遷移：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示(圖3)，對照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移率分別為69.58%±6.73%和34.84%±3.84%，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移率顯著少于對照組(P<0.01)，表明高表達(dá)miR-4715-5p可抑制MCF-7細(xì)胞的遷移。

圖3 高表達(dá)miR-4715-5p對MCF-7細(xì)胞遷移的影響 結(jié)晶紫染色,×100

4.高表達(dá)miR-4715-5p抑制MCF-7細(xì)胞的增殖：CCK-8法顯示(圖4)，接種MCF-7細(xì)胞第2天開始，與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖能力顯著降低(P<0.05)，表明高表達(dá)miR-4715-5p可抑制MCF-7細(xì)胞的增殖。

圖4 高表達(dá)miR-4715-5p對MCF-7細(xì)胞增殖的影響 與實(shí)驗(yàn)組比較，*P<0.05，**P<0.01

5.生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-4715-5p的靶基因：采用miRNAMap、miRWalk、PicTar軟件預(yù)測，miR-4715-5p互補(bǔ)結(jié)合的靶基因可能是MUC1，MUC1 mRNA突變序列見圖5。

圖5 miR-4715-5p與MUC1 mRNA互補(bǔ)結(jié)合的序列

6.雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-4715-5p互補(bǔ)結(jié)合MUC1 mRNA：雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)顯示，野生型質(zhì)粒+NC組和野生型質(zhì)粒+miR-4715-5p組的相對熒光素酶活性分別為1.02±0.11和0.33±0.06，野生型質(zhì)粒+miR-4715-5p組相對熒光素酶活性被抑制(P<0.01)，而突變型質(zhì)粒+NC組和突變型質(zhì)粒+miR-4715-5p組相對熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明miR-4715-5p可互補(bǔ)結(jié)合MUC1 mRNA，詳見圖6。

圖6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證 miR-4715-5p的靶基因

7.高表達(dá)miR-4715-5p對MUC1 mRNA表達(dá)的影響：qRT-PCR實(shí)驗(yàn)顯示，對照組和實(shí)驗(yàn)組MCF-7細(xì)胞中MUC1 mRNA表達(dá)分別為1.06±0.21和0.22±0.07，表明高表達(dá)miR-4715-5p可抑制MUC1 mRNA的表達(dá)(P<0.01)。

8.高表達(dá)miR-4715-5p對MUC1蛋白及PI3K/AKT信號通路蛋白表達(dá)的影響：Western blot法實(shí)驗(yàn)顯示，高表達(dá)miR-4715-5p后，MCF-7細(xì)胞中MUC1蛋白表達(dá)降低，PI3K/AKT信號通路蛋白p-PI3K、p-AKT、p-PDK1、MDM2表達(dá)降低(圖7)。

圖7 高表達(dá)miR-4715-5p對MCF-7細(xì)胞MUC1 蛋白及PI3K/AKT信號通路蛋白表達(dá)的影響

討 論

miRNA是一類由19～22個核苷酸組成的非編碼RNA，通過與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)不完全互補(bǔ)結(jié)合，誘導(dǎo)靶基因mRNA的降解或者抑制其翻譯，導(dǎo)致靶基因蛋白表達(dá)降低，從而參與細(xì)胞的各種生理和病理活動[9, 10]。越來越多的研究表明，miRNA可發(fā)揮癌基因或抑癌基因功能，通過調(diào)控靶基因表達(dá)，參與調(diào)控各種信號通路的活化，影響腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展[11, 12]。Cui等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在人乳腺癌組織和MCF-7細(xì)胞中，miR-216a的表達(dá)水平均顯著降低，高表達(dá)miR-216a可抑制MCF-7細(xì)胞的遷移并促進(jìn)其凋亡。Mansoori等[14]研究發(fā)現(xiàn)，與正常組織比較，miR-142-3p在乳腺癌組織中表達(dá)水平下調(diào)，高表達(dá)miR-142-3p可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，上調(diào)miR-142-3p可誘導(dǎo)多種抑癌miRNA包括miR-330，miR-145和miR-34a的表達(dá)。近年來的研究顯示，miR-4715-5p在肺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)水平顯著降低，高表達(dá)miR-4715-5p可顯著抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和細(xì)胞周期，干擾miR-4715-5p表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，miR-4715-5p發(fā)揮明顯的抑癌基因功能[8]。miR-4715-5p在乳腺癌細(xì)胞中的功能和分子作用機(jī)制尚不清楚。

本研究顯示，與癌旁組織比較，乳腺癌組織中miR-4715-5p的表達(dá)水平顯著降低；與正常乳腺細(xì)胞比較，乳腺癌細(xì)胞系中miR-4715-5p的表達(dá)水平顯著降低，提示miR-4715-5p可能參與乳腺癌發(fā)生、進(jìn)展。采用體外轉(zhuǎn)染法高表達(dá)miR-4715-5p后，可顯著抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的遷移和增殖，miR-4715-5p在乳腺癌中發(fā)揮明顯的抑癌基因功能。本研究采用miRNAMap、miRWalk、PicTar軟件預(yù)測，黏蛋白1(mucins 1，MUC1)可能是miR-4715-5p的靶基因。MUC1是一種高度糖基化的跨膜蛋白，主要表達(dá)于上皮細(xì)胞，介導(dǎo)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，與細(xì)胞的黏附和增殖密切相關(guān)[15, 16]。MUC1在結(jié)腸癌、胰腺癌、卵巢癌等腫瘤中明顯高表達(dá)，與腫瘤的惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不良預(yù)后存在相關(guān)性[17, 18]。MUC1在乳腺癌組織中高表達(dá)，MUC1可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞對他莫昔芬的耐藥，MUC1表達(dá)較高的乳腺癌患者預(yù)后較差，沉默MUC1可抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和生長[19, 20]。本研究采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)證明，miR-4715-5p與MUC1可互補(bǔ)結(jié)合。本研究高表達(dá)miR-4715-5p后，MUC1基因表達(dá)顯著降低，進(jìn)一步證明MUC1是miR-4715-5p的靶基因。PI3K/AKT信號通路是腫瘤細(xì)胞獲得異常轉(zhuǎn)移和增殖能力的關(guān)鍵機(jī)制[21]。Western blot法顯示，MUC1蛋白表達(dá)降低后，PI3K/AKT信號通路蛋白p-PI3K、p-AKT、p-PDK1、MDM2表達(dá)顯著降低，PI3K/AKT信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)被抑制，表明細(xì)胞的遷移和增殖能力降低。

綜上所述，本研究證實(shí)乳腺癌組織和細(xì)胞系中miR-4715-5p的表達(dá)水平顯著降低，高表達(dá)miR-4715-5p可通過干擾MUC1基因表達(dá)，阻滯PI3K/AKT信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的遷移和增殖。本研究可能為乳腺癌發(fā)病機(jī)制研究和分子靶向治療提供新的方向。