何 艷 布海切木·卡德爾 周曉珊 馬彩玲 楊振華

骨質(zhì)疏松癥是一種全身性的骨代謝疾病，其特點(diǎn)是骨量減少、骨密度降低、骨組織微結(jié)構(gòu)退化[1]。由于其患者在臨床上發(fā)病緩慢且沒有特定癥狀，因此被多數(shù)人忽視，特別是女性在絕經(jīng)后因缺乏雌激素導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松[2]。然而，藥物治療有一定局限性[3]。因此，尋找有效的預(yù)防措施和治療藥物是非常必要的。

藏紅花是一種中草藥植物，可作為香料和食品著色劑使用，也可用于中醫(yī)治療和作為鎮(zhèn)靜劑、祛痰藥和催吐藥[4]。藏紅花素是藏紅花的一種成分[5]。藏紅花素的藥理作用已被證實(shí)，包括抗腫瘤、抗炎癥、抗焦慮等方面[6～8]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，藏紅花素對(duì)骨疾病如骨肉瘤、關(guān)節(jié)軟骨退變有保護(hù)作用[9]。但藏紅花素對(duì)骨質(zhì)疏松癥的報(bào)道鮮少，且其具體的分子機(jī)制也不明確。本研究探討了藏紅花素對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠和成骨細(xì)胞凋亡的影響及其分子機(jī)制，為臨床治療骨質(zhì)疏松癥提供可能的治療靶點(diǎn)。

材料與方法

1.材料：40只8周齡SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠(體質(zhì)量21～24g)；藏紅花素(美國Sigma-Aldrich公司)；雌激素(華北制藥股份有限公司)；LY294002(PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑)和OC、ALP檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt抗體(美國CST公司)；β-actin抗體(上海相比生物公司)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青霉素和鏈霉素(美國Sigma公司)；堿性磷酸酶(ALP)染色試劑盒(上海古朵生物科技有限公司)；Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(美國BD公司)。

2.骨質(zhì)疏松模型建立及給藥：小鼠隨機(jī)分為4組(n=10)，包括假手術(shù)組、模型組、雌激素組和藏紅花素組。參考Morris等[10]的研究，小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉，接受雙側(cè)開腹手術(shù)(假手術(shù)組)或雙側(cè)卵巢切除手術(shù)(模型組)。術(shù)后恢復(fù)4周，對(duì)造模成功的兩組小鼠每天分別進(jìn)行雌激素(25μg/kg)和藏紅花素(20mg/kg)灌胃治療，對(duì)假手術(shù)組和另一模型組進(jìn)行等量蒸餾水灌胃，連續(xù)灌胃12周[11]。實(shí)驗(yàn)期間，每隔兩周，對(duì)小鼠稱重1次。

3.小鼠樣本收集：在小鼠末次給藥后，禁食24h，收集小鼠尿液，用2ml(1mol/L)的鹽酸酸化。腹腔注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉，取眼球放血，1500×g離心10min提取血清。處死小鼠取左右腿股骨，浸泡在10%甲醛內(nèi)，-20℃保存。

4.子宮指數(shù)：子宮指數(shù)=子宮質(zhì)量(mg)/小鼠體質(zhì)量(g)

5.骨密度檢測(cè)：采用雙能X線骨密度分析儀掃描和測(cè)量骨密度。測(cè)量結(jié)果以每平方厘米表面積的礦物含量克表示。

6.HE染色觀察股骨組織病理學(xué)形態(tài)：將小鼠股骨脫鈣處理1周，石蠟包埋和切片(5μm厚)。再依次進(jìn)行二甲苯脫蠟、乙醇脫色、蘇木精染色、分化、洗滌、伊紅染色。最后在顯微鏡下觀察。

7.骨代謝生化指標(biāo)檢測(cè)：利用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)小鼠血清和尿液中Ca、P以及尿液中Cr含量，利用OC、ALP的ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠血清中OC、ALP水平。所有步驟均按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行(n=3)。

8.Western blot法檢測(cè)骨組織p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白表達(dá)：根據(jù)Schreiweis等[12]描述的方法提取骨蛋白。將裂解液離心、定量，經(jīng)SDS-PAGE電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，5%牛奶室溫封閉1h，將PVDF膜孵育在p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、β-actin一抗孵育液中4℃過夜；再與相應(yīng)二抗室溫孵育1h，再用磷酸緩沖液(PBS)洗滌。最后用ECL顯影。

9.小鼠成骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定：采用胰蛋白酶-膠原酶消化法和組織培養(yǎng)法提取原代成骨細(xì)胞。取小鼠脛骨并去骨膜，用PBS沖洗直到呈白色或透明。用眼剪將脛骨剪成約11mm的碎片。用0.25%胰酶消化變白，再于37℃、200r/min離心60min。離心得到白色沉淀，收集上清，用含10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)在細(xì)胞瓶。每隔10min轉(zhuǎn)移至新細(xì)胞瓶培養(yǎng)，重復(fù)兩次，得到高純度的成骨細(xì)胞懸液。選擇第4代成骨細(xì)胞進(jìn)行ALP染色鑒定及實(shí)驗(yàn)，ALP染色按試劑盒說明書進(jìn)行。

10.成骨細(xì)胞分組與處理：將成骨細(xì)胞分為假手術(shù)組、模型組、藏紅花素組、LY249002組、藏紅花素+LY249002組。前兩組可直接從小鼠提取，藏紅花素組是在模型組中加4mmol/L藏紅花素，LY249002組是在模型組細(xì)胞中加5μmol/L的LY249002，藏紅花素+LY249002組是在模型組細(xì)胞中加了4mmol/L的藏紅花素和5μmol/L的LY249002。

11.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組成骨細(xì)胞凋亡：將成骨細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞密度為2×105個(gè)細(xì)胞/孔，培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞。用含5μl Annexin Ⅴ-FITC和5μl碘化丙啶(PI，1μg/ml)的300μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，PBS洗兩次，冰浴0.5h，再根據(jù)FACScan分析。

結(jié) 果

1.藏紅花素改善模型小鼠體質(zhì)量變化：在灌胃給藥12周內(nèi)，假手術(shù)組小鼠體質(zhì)量增加緩慢，模型組小鼠體質(zhì)量增長迅速(P=0.000)，與模型組比較，雌激素組和藏紅花素組顯著抑制了小鼠體質(zhì)量的增加(P<0.01，圖1)。

2.藏紅花素升高模型小鼠子宮指數(shù)：與假手術(shù)組比較，模型組小鼠子宮指數(shù)降低(P<0.01)。與模型組比較，雌激素組和藏紅花素組增加了小鼠子宮指數(shù)(P<0.01，圖2)。

3.藏紅花素改善模型小鼠骨組織病理形態(tài)：雙能X線骨密度分析顯示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠骨小梁密度顯著降低，而與模型組比較，雌激素組和藏紅花素組顯著提高了骨小梁密度(圖3A，P<0.05)。HE染色發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組骨小梁分布均勻，排列有序，骨小梁之間間隔小，模型組骨小梁分布稀疏，排列分散且有斷點(diǎn)，與模型組比較，雌激素組和藏紅花素組都改善了骨質(zhì)疏松小鼠骨小梁分布與排列(圖3B)。

4.藏紅花素抑制模型小鼠尿液中U-Ca/Cr、U-P/Cr升高：生化分析顯示，各組小鼠血清中S-Ca或S-P含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4A、B)；與假手術(shù)組比較，模型組小鼠尿液中U-Ca/Cr和U-P/Cr水平升高，分別為104.5%和36.9%，與模型組比較，雌激素組和藏紅花素組均能抑制U-Ca/Cr和U-P/Cr水平升高(P<0.05，圖4C、D)。

5.藏紅花素增加模型小鼠血清中OC、ALP水平：ELISA結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠血清中OC、ALP水平升高，而與模型組比較，雌激素組和藏紅花素組均顯現(xiàn)出降低了OC、ALP水平(P<0.05，圖5)。

圖3 各組小鼠骨密度和骨形態(tài)變化 A.骨密度檢測(cè) ；B.HE染色(×200)；*P<0.05,**P<0.01

圖4 各組小鼠血清和尿液中Ca、P、Cr水平 *P<0.05,**P<0.01,***P=0.000

圖5 各組小鼠血清中OC、ALP水平 *P<0.05,**P<0.01

6.藏紅花素調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路：通過Western blot法檢測(cè)骨組織中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白表達(dá)。與假手術(shù)組比較，模型組小鼠骨組織中PI3K/Akt蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，與模型組比較，雌激素組和藏紅花素組均上調(diào)PI3K/Akt蛋白表達(dá)(P<0.05,圖6)。

圖6 藏紅花素調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路 *P<0.05,**P<0.01,***P=0.000

7.藏紅花素抑制成骨細(xì)胞凋亡：原代培養(yǎng)假手術(shù)組和模型組小鼠成骨細(xì)胞，經(jīng)ALP染色鑒定為成骨細(xì)胞(P<0.01，圖7A、B)。再經(jīng)Western blot法檢測(cè)p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)蛋白表達(dá)在模型組中低于假手術(shù)組；藏紅花素組多于模型組，LY249002組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而與藏紅花素組比較，藏紅花素+LY249002組蛋白表達(dá)被抑制，說明LY249002成功抑制了PI3K/Akt信號(hào)通路(P<0.05，圖7C、D)。流式細(xì)胞術(shù)顯示，與假手術(shù)組比較，模型組成骨細(xì)胞凋亡顯著增多；與模型組比較，藏紅花素組抑制了成骨細(xì)胞凋亡，LY249002組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但與藏紅花素組比較，藏紅花素+LY249002組抵消了藏紅花素對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的抑制作用(P=0.000，圖7E、F)。

討 論

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少和骨組織微結(jié)構(gòu)退化為特征的骨代謝疾病，常見于絕經(jīng)后女性，由于雌激素分泌不足導(dǎo)致她們對(duì)骨質(zhì)疏松癥的易感性明顯增加[1]。研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松癥抑制骨細(xì)胞分化和形成，降低骨質(zhì)量和強(qiáng)度[11]。目前，骨質(zhì)疏松癥正成為主要公共衛(wèi)生威脅。因此，探索治療骨質(zhì)疏松的有效藥物至關(guān)重要。

藏紅花是一種草本植物，具有很強(qiáng)的抗氧化性能[12]。藏紅花素是藏紅花顏色的主要化學(xué)成分，是西紅花中一類主要藥用成分，主要在治療阿爾茲海默病、腫瘤、炎癥等疾病有作用[4，6，7，13]。最新研究發(fā)現(xiàn)，藏紅花素可減輕代謝綜合征引起的大鼠骨質(zhì)疏松癥，但其分子機(jī)制未有報(bào)道[14]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，藏紅花素抑制去卵巢骨質(zhì)疏松鼠體質(zhì)量增加和骨密度降低，防止骨小梁微結(jié)構(gòu)惡化。此外，還抑制了尿液中U-Ca/Cr、U-P/Cr和血清中OC、ALP水平的升高。OC和ALP都是骨代謝和骨形成的標(biāo)志物，對(duì)成骨細(xì)胞凋亡有重要作用[15]。筆者還發(fā)現(xiàn)藏紅花素抑制成骨細(xì)胞凋亡，而成骨細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的部分原因。因此，藏紅花素可能通過抑制成骨細(xì)胞凋亡對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠具有保護(hù)作用。

PI3K/Akt是參與調(diào)控細(xì)胞代謝、生長、增殖、死亡和存活的重要信號(hào)通路，也是干預(yù)多種疾病的前提[16]。此外，它還可影響骨形成和骨細(xì)胞存活，從而控制骨密度平衡[17]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號(hào)通路在去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠中被抑制，而藏紅花素可調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路中關(guān)鍵分子表達(dá)。同時(shí)在成骨細(xì)胞中加入藏紅花素抑制成骨細(xì)胞凋亡。而當(dāng)在模型小鼠成骨細(xì)胞中加入藏紅花素和LY249002時(shí)，藏紅花素對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的抑制作用則被抵消。因此，藏紅花素可能通過調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路來抑制骨質(zhì)疏松小鼠成骨細(xì)胞凋亡。

綜上所述，藏紅花素可通過調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路抑制成骨細(xì)胞凋亡，進(jìn)而對(duì)去卵巢誘發(fā)的骨質(zhì)疏松癥具有保護(hù)作用。