胡森安，艾紅紅，葉雪蓮，成江燕

（廣東醫(yī)科大學(xué)附屬高明醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 佛山 528500）

膿毒癥屬于由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）。膿毒癥早期如果未得到及時(shí)、有效的控制，可進(jìn)一步發(fā)展成嚴(yán)重膿毒癥、膿毒癥休克，甚至是多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）。近年來，隨著對(duì)膿毒癥發(fā)病機(jī)制的深入了解，各種新藥物、新方法不斷應(yīng)用于膿毒癥的臨床治療中，但膿毒癥的病死率依然居高不下。有研究結(jié)果顯示，全球每天約有14 000例患者死于膿毒癥及其并發(fā)癥，膿毒癥更是重癥監(jiān)護(hù)病房（intensive care unit，ICU）患者死亡的首要原因[1]。膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展是復(fù)雜的病理生理過程。有研究結(jié)果顯示，膿毒癥與感染、炎癥、免疫和凝血系統(tǒng)功能改變等因素有關(guān)[2]。白細(xì)胞介素35（interleukin 35，IL-35）是白細(xì)胞家族新發(fā)現(xiàn)的成員，是重要的抗炎細(xì)胞因子，在機(jī)體免疫力調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的功能。有研究結(jié)果顯示，感染性休克及膿毒癥小鼠模型中IL-35表達(dá)升高[3]。目前關(guān)于IL-35在膿毒癥患者中的變化及其與病情嚴(yán)重程度的關(guān)系研究較少。補(bǔ)體系統(tǒng)是患者對(duì)抗病原體感染的重要組成部分。但有研究結(jié)果顯示，補(bǔ)體系統(tǒng)的過度活化會(huì)導(dǎo)致膿毒癥病情惡化[4]。而補(bǔ)體系統(tǒng)與凝血纖溶系統(tǒng)存在復(fù)雜的交叉激活網(wǎng)絡(luò)[5]。為此，本研究擬探討膿毒癥患者補(bǔ)體C3和IL-35變化與病情嚴(yán)重程度及預(yù)后的關(guān)系，以期為膿毒癥的診治提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2014年1月—2018年12月廣東醫(yī)科大學(xué)附屬高明醫(yī)院ICU收治的膿毒癥患者112例，去除原發(fā)性免疫缺陷病、自身免疫性疾病27例，未在ICU 24 h內(nèi)采集血液樣本的患者5例，最終納入80例膿毒癥患者，其中男43例、女37例，年齡48～72歲；膿毒癥45例（膿毒癥組），原發(fā)疾病包括膿毒癥伴肺炎、嚴(yán)重皮膚軟組織感染、急性腹瀉、心肺復(fù)蘇術(shù)后等；嚴(yán)重膿毒癥患者35例（嚴(yán)重膿毒癥組），包括膿毒癥伴有急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）、心血管功能障礙或多個(gè)其他器官功能障礙，其中單器官功能障礙12例（單器官功能障礙組）、MODS 16例（MODS組）、死亡（入ICU 28 d內(nèi)死亡，包括搶救無效死亡、積極搶救無法恢復(fù)自主呼吸和心跳而放棄治療的患者）7例（死亡組）。膿毒癥、嚴(yán)重膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中國(guó)嚴(yán)重膿毒癥/膿毒性休克治療指南（2014）》[6]。本研究經(jīng)廣東醫(yī)科大學(xué)附屬高明醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理道德委員會(huì)批準(zhǔn)，均由研究對(duì)象本人或其家屬簽署知情同意書。

1.2 方法

根據(jù)患者住院期間的病史記載及輔助檢查結(jié)果，記錄患者年齡、性別、感染部位、基礎(chǔ)疾病及轉(zhuǎn)歸等資料，輔助檢查結(jié)果包括患者轉(zhuǎn)入ICU后24 h內(nèi)采集血標(biāo)本檢測(cè)血常規(guī)、體液免疫指標(biāo)、凝血功能、肝功能、腎功能、心肌酶譜和IL-35的結(jié)果以及由24 h內(nèi)檢測(cè)值最差的臨床指標(biāo)計(jì)算出的急性生理與慢性健康評(píng)分Ⅱ（acute physiology and chronic health evaluationⅡ，APACHEⅡ），記錄患者病程中發(fā)生休克、MODS的情況。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

在入ICU 24 h內(nèi)采集所有患者的靜脈血2 mL。采用BNⅡ全自動(dòng)特定蛋白分析儀（德國(guó)西門子公司）及配套試劑檢測(cè)IgG、IgA、IgM、C3、C4。采用XN-1000全自動(dòng)血液分析儀（日本Sysmex公司）及配套試劑檢測(cè)血常規(guī)[白細(xì)胞（white blood cell，WBC）計(jì)數(shù)、血小板（platelet，PLT）計(jì)數(shù)]。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、總膽紅素（total bilirubin，TB）、肌酐（creatinine，Cr）、肌酸激酶MB同工酶（creatine kinase isoenzyme MB，CK-MB）試劑購(gòu)自四川邁克生物科技有限公司，檢測(cè)儀器為7600全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司）。采用CA7000全自動(dòng)凝血分析儀（日本Sysmex公司）及配套試劑檢測(cè)凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值（international standardized ratio，INR）、活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）、纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)ib）。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)IL-35，試劑盒購(gòu)自美國(guó)Biosamite公司，檢測(cè)范圍為18.5～4 000.0 pg/mL，最低檢測(cè)限為8.6 pg/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線r≥0.995，批內(nèi)變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）＜8%，批間CV＜10%，嚴(yán)格按說明書進(jìn)行操作。所有檢測(cè)項(xiàng)目均采用高、低2水平質(zhì)控品進(jìn)行質(zhì)量控制，確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，2個(gè)組之間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)分析和Spearman秩相關(guān)分析評(píng)估C3、IL-35與其他臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膿毒癥組和嚴(yán)重膿毒癥組各項(xiàng)指標(biāo)的比較

膿毒癥組WBC計(jì)數(shù)及C3、C4、PLT計(jì)數(shù)、Fib水平均高于嚴(yán)重膿毒癥組（P＜0.05），PT、APTT、INR、ALT、TB、CK-MB、Cr、IL-35水平均低于嚴(yán)重膿毒癥組（P＜0.05），而2個(gè)組之間年齡、性別及IgG、IgA、IgM水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 膿毒癥組和嚴(yán)重膿毒癥組各項(xiàng)指標(biāo)的比較

2.2 不同膿毒癥病情患者C3和IL-35水平的比較

與膿毒癥組比較，單器官功能障礙組、MODS組及死亡組C3水平均顯著降低（P=0.001），且有隨病情嚴(yán)重程度增加而降低的趨勢(shì)；IL-35則顯著升高（P＜0.001），且有隨病情嚴(yán)重程度增加而升高的趨勢(shì)。見表2。

2.3 C3、IL-35與各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性分析

C3與PLT計(jì)數(shù)、Fib呈正相關(guān)（r值分別為0.32、0.52，P＜0.001），與PT、INR、APTT、ALT、TB、Cr、CK-MB均呈負(fù)相關(guān)（r值分別為-0.34、-0.38、-0.33、-0.31、-0.27、-0.25、-0.26，P＜0.001）。IL-35與PLT計(jì)數(shù)、Fib呈負(fù)相關(guān)（r值分別為-0.33、-0.59，P＜0.001），與PT、INR、APTT、ALT、TB、Cr、CK-MB均呈正相關(guān)（r值分別為0.41、0.32、0.25、0.42、0.34、0.29、0.26，P＜0.001）。

表2 不同膿毒癥病情患者C3和IL-35水平的比較

2.4 C3、IL-35與膿毒癥患者APACHEⅡ評(píng)分及預(yù)后（死亡）的相關(guān)性

根據(jù)APACHEⅡ評(píng)分將80例膿毒癥患者分為＞25分組（38例）和≤25分組（42例）。結(jié)果顯示，APACHEⅡ評(píng)分≤25分組C3水平顯著高于APACHEⅡ評(píng)分＞25分組（P＜0.05），IL-35顯著低于APACHEⅡ評(píng)分＞25分組（P＜0.001）。見表3。

APACHEⅡ評(píng)分≤25分組C3水平與預(yù)后（死亡）呈負(fù)相關(guān)（r=-0.63，P＜0.05），IL-35水平與預(yù)后（死亡）呈正相關(guān)（r=0.54，P＜0.001）。

表3 不同APACHEⅡ評(píng)分膿毒癥患者C3、IL-35水平的比較

3 討論

膿毒癥是由適應(yīng)性免疫和固有免疫共同組成的復(fù)雜炎癥反應(yīng)，血管內(nèi)皮系統(tǒng)、補(bǔ)體系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)等參與了整個(gè)反應(yīng)過程。另外，患者的基礎(chǔ)疾病、年齡、基因變異、致病微生物及營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)均影響著機(jī)體免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱。因此，單一控制某一方面的因素?zé)o法有效改善膿毒癥患者的預(yù)后。膿毒癥的早期識(shí)別及干預(yù)成為臨床治療的重要方向。

目前，新型抗炎細(xì)胞因子及共抑制分子逐漸成為臨床免疫學(xué)研究中的重要方向之一，日益受到關(guān)注與重視[7]。IL-35是白細(xì)胞介素家族新發(fā)現(xiàn)的成員，主要由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞產(chǎn)生，具有抑制效應(yīng)T細(xì)胞增殖、輔助性T細(xì)胞17分化、白細(xì)胞介素47合成以及維持外周免疫耐受等重要作用。有研究結(jié)果顯示，IL-35與多種疾病，如感染性疾病、膿毒癥、自身免疫性疾病、炎癥及腫瘤等密切相關(guān)，有望成為反映疾病病情進(jìn)展和預(yù)后的新生物標(biāo)志物或作為疾病治療的新靶點(diǎn)[8]。有研究結(jié)果顯示，膿毒癥時(shí)產(chǎn)生IL-35的炎性細(xì)胞處于高度活化狀態(tài)，導(dǎo)致IL-35水平升高[9]。本研究結(jié)果顯示，發(fā)生隨著膿毒癥患者病情的加重，IL-35水平顯著升高，與文獻(xiàn)報(bào)道[10]一致，其原因可能為：在嚴(yán)重膿毒癥以及多器官功能障礙時(shí)期，機(jī)體處于“免疫麻痹”狀態(tài)，抗炎介質(zhì)的表達(dá)占據(jù)優(yōu)勢(shì)，機(jī)體通過分泌IL-35發(fā)揮自我保護(hù)作用。本研究結(jié)果還顯示，IL-35與PLT計(jì)數(shù)、Fib呈負(fù)相關(guān)（r值分別為-0.33、-0.59，P＜0.001），與PT、INR、APTT、ALT、TB、Cr、CK-MB及預(yù)后（死亡）均呈正相關(guān)（r值分別為0.41、0.32、0.25、0.42、0.34、0.29、0.26，P＜0.001）。在臨床實(shí)際工作中，急診膿毒癥患者中有很大一部分會(huì)在72 h內(nèi)快速進(jìn)展為嚴(yán)重膿毒癥，12 h內(nèi)盡早使用抗菌藥物有助于降低重度膿毒癥患者的病死率。因此，采用APACHEⅡ評(píng)分早期判斷膿毒癥患者病情對(duì)患者預(yù)后評(píng)估有很大價(jià)值。本研究結(jié)果也顯示，膿毒癥患者的IL-35水平隨APACHEⅡ評(píng)分的升高而升高，提示IL-35水平不僅可用于評(píng)估膿毒癥患者病情的嚴(yán)重程度，或許還可作為預(yù)測(cè)膿毒癥患者預(yù)后的指標(biāo)。

補(bǔ)體系統(tǒng)一直被認(rèn)為在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。但最近的研究結(jié)果顯示，補(bǔ)體在膿毒癥發(fā)展過程中起的作用具有兩面性。補(bǔ)體的激活在機(jī)體處于膿毒癥初始階段時(shí)是免疫系統(tǒng)抵御病原體入侵的重要途徑，低水平的C3可導(dǎo)致膿毒癥小鼠的病死率明顯升高[11]。另一方面，在嚴(yán)重膿毒癥后期，C3轉(zhuǎn)化酶抑制劑或補(bǔ)體活化物C5a抑制劑的使用均能提高膿毒癥動(dòng)物模型的生存率，表明補(bǔ)體系統(tǒng)的過度活化在膿毒癥導(dǎo)致的器官損傷和凝血纖溶系統(tǒng)異常過程中起重要作用。本研究結(jié)果顯示，嚴(yán)重膿毒癥患者C3水平顯著低于膿毒癥患者（P＜0.001），且隨著病情的加重而逐漸降低。出現(xiàn)這種情況的主要原因可能是嚴(yán)重膿毒癥患者補(bǔ)體系統(tǒng)被過度激活后C3被過多消耗，且隨著病情的加重，作為補(bǔ)體生成主要場(chǎng)所的肝臟也受到損傷，從而導(dǎo)致補(bǔ)體生成減少。另外，本研究結(jié)果顯示，C3與肝臟、腎臟、心臟等重要器官的損傷指標(biāo)ALT、TB、Cr、CK-MB均呈負(fù)相關(guān)（r值分別為-0.31、-0.27、-0.25、-0.26，P＜0.001）。這說明補(bǔ)體系統(tǒng)的過度活化可能參與了膿毒癥患者的器官損傷，過度的免疫反應(yīng)在嚴(yán)重膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展過程中起促進(jìn)作用。目前，關(guān)于補(bǔ)體過度活化導(dǎo)致器官損傷的機(jī)制尚未被完全闡明，可能與補(bǔ)體系統(tǒng)過度激活導(dǎo)致炎性反應(yīng)失控和組織損傷有關(guān)。補(bǔ)體活化物C5a能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的釋放來促進(jìn)粒細(xì)胞集落刺激因子產(chǎn)生，吸引中性粒細(xì)胞聚集，在吞噬病原體的過程中釋放多種酶類物質(zhì)引起組織器官損傷。補(bǔ)體系統(tǒng)與凝血及纖溶系統(tǒng)間存在復(fù)雜的交叉激活網(wǎng)絡(luò)，凝血及纖溶系統(tǒng)可通過裂解C3、C1等激活補(bǔ)體系統(tǒng)，而補(bǔ)體活化物又可進(jìn)一步激活凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，二者相互激活、過度活化，最終導(dǎo)致病情惡化。本研究結(jié)果顯示，C3與PT、INR、APTT呈負(fù)相關(guān)（r值分別為-0.34、-0.38、-0.33，P＜0.001），與PLT計(jì)數(shù)、Fib呈正相關(guān)（r值分別為0.32、0.52，P＜0.001），表明補(bǔ)體系統(tǒng)過度活化導(dǎo)致的補(bǔ)體消耗與凝血止血系統(tǒng)功能有關(guān)。因此，補(bǔ)體系統(tǒng)活化與膿毒癥患者的器官損傷、凝血異常密切相關(guān)。C3水平降低與嚴(yán)重膿毒癥患者預(yù)后（死亡）有關(guān)。

綜上所述，C3和IL-35可能參與了膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展，與膿毒癥患者的凝血功能障礙及器官損傷有關(guān)，或可用于膿毒癥的病情判斷及預(yù)后評(píng)估。但C3和IL-35在膿毒癥進(jìn)展中的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。