安崇文，李海霞，焦莉莉

（北京大學(xué)第一醫(yī)院，北京 100034）

血清蛋白電泳（serum protein electrophoresis，SPE）是指采用電泳方法測(cè)定血清中各類蛋白質(zhì)的百分比，對(duì)于肝臟疾病、腎臟疾病和多發(fā)性骨髓瘤的診斷有重要意義。目前，SPE的方法較多，有醋酸纖維素薄膜電泳（cellulose acetate membrane electrophoresis，CAME）、瓊脂糖凝膠電泳（agarose gel electrophoresis，AGE）和毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）等，不同方法的檢測(cè)結(jié)果之間會(huì)有一定的差異。目前，采用CAME[1-2]和AGE[3-4]進(jìn)行SPE的參考區(qū)間已有報(bào)道。國(guó)內(nèi)采用CE進(jìn)行SPE的儀器大多為Capillarys全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀（法國(guó)Sebia公司），相關(guān)研究也是基于該儀器的結(jié)果[5]，有關(guān)V8 Nexus高速自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀（簡(jiǎn)稱V8毛細(xì)管電泳儀）（CE法）檢測(cè)SPE的參考區(qū)間國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。故本研究依據(jù)我國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T 402—2012《臨床實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)項(xiàng)目參考區(qū)間的制定》[6]建立基于V8毛細(xì)管電泳儀的SPE參考區(qū)間，為其在臨床中的應(yīng)用提供幫助。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年7—9月北京大學(xué)第一醫(yī)院體檢中心進(jìn)行健康體檢的成年人，體檢項(xiàng)目包括內(nèi)科檢查、外科檢查、肝功能、腎功能、血糖、血脂、甲狀腺功能5項(xiàng)、腫瘤標(biāo)志物篩查、全血細(xì)胞分析、尿液全項(xiàng)分析、血壓、胸片、心電圖、B超等。依據(jù)我國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T 402—2012[6]的要求制定入選標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)家族病遺傳病史，女性不在妊娠期或哺乳期，無(wú)心腦血管疾病，無(wú)肝、腎、肺、胰等重要器官功能障礙，近期無(wú)大量飲酒或酗酒，近期無(wú)手術(shù)史、住院史、輸血史或服藥史。最終入組表面健康者649名，其中男318名，年齡19～78歲；女331名，年齡18～85歲。按年齡分為5組：18～29歲組、30～39歲組、40～49歲組、50～59歲組及≥60歲組。不同性別之間年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 樣本采集

樣本的處理與儲(chǔ)存按照WS/T 225—2002《臨床化學(xué)檢驗(yàn)血液標(biāo)本的收集與處理》規(guī)定進(jìn)行，研究對(duì)象樣本采集前1天無(wú)大量飲酒、無(wú)劇烈運(yùn)動(dòng)、無(wú)高脂飲食，樣本采集當(dāng)日早上7：00—9：00，以坐姿在靜息狀態(tài)下采集空腹靜脈血4 mL，注入含分離膠的采血管中，立即顛倒混勻5次以上，室溫靜置，3 h內(nèi)以2 860×g離心5 min，分離血清，血清應(yīng)無(wú)溶血、黃疸、脂血或乳糜血等，于8 h內(nèi)采用V8毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行SPE。

1.3 儀器與試劑

V8毛細(xì)管電泳儀（英國(guó)Helena Biosciences Europe公司）及配套試劑[V8 Serum Protein SPE Kit（批號(hào)11412284）、V8 Storage Buffer（批號(hào)11531444）、V8 Maintenance Buffer（批號(hào)11518852）、Serum Control-Normal（批號(hào)11394452）、Serum Control-Abnormal（批號(hào)11404273）]。由于不同的電泳參數(shù)會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響，故本研究嚴(yán)格控制電泳條件：試劑溫度15 ℃、毛細(xì)管溫度20 ℃、電壓7.9 kV、Tris緩沖液pH10，電泳時(shí)間290 s，紫外光波長(zhǎng)214 nm。

檢測(cè)系統(tǒng)均嚴(yán)格執(zhí)行質(zhì)量控制，進(jìn)行正常和異常室內(nèi)質(zhì)控品檢測(cè)，結(jié)果均符合要求，批內(nèi)、批間變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）分別低于我國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心規(guī)定允許總誤差的1/4和1/3。檢測(cè)國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心室間質(zhì)量評(píng)價(jià)和美國(guó)病理學(xué)家協(xié)會(huì)（College of American Pathologists，CAP）發(fā)放的質(zhì)控品，結(jié)果均合格。儀器操作嚴(yán)格按照生產(chǎn)廠商的要求進(jìn)行，并準(zhǔn)確無(wú)誤地記錄檢測(cè)結(jié)果。

1.4 評(píng)價(jià)方法

依據(jù)我國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T 402—2012《臨床實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)項(xiàng)目參考區(qū)間的制定》[6]建立參考區(qū)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Excel 2016、SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Kolmogorov-Smirnov法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。呈正態(tài)分布或近似正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，2個(gè)組之間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 離群值檢查

將檢測(cè)結(jié)果從小到大排列，計(jì)算全距或極差（R值）、極大值和極小值與其相鄰值之差（D值）、極大值和極小值的統(tǒng)計(jì)量（Q值）。結(jié)果顯示，男性和女性白蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β1球蛋白、β2球蛋白、γ球蛋白、β球蛋白的Q值均＜1/3，表明無(wú)離群值存在。

2.2 數(shù)據(jù)分布

計(jì)算所有數(shù)據(jù)的偏度系數(shù)和峰度系數(shù)及其各自的標(biāo)準(zhǔn)誤，計(jì)算Z分?jǐn)?shù)單位值和其概率P值，繪制帶正態(tài)分布概率密度曲線直方圖、P-P概率圖和Q-Q概率圖，初步評(píng)估正態(tài)性，采用Kolmogorov-Smirnov法進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，男性組和女性組所有數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布或近似正態(tài)分布（P＞0.05）。

2.3 不同性別表面健康者的SPE結(jié)果

男性表面健康者白蛋白、α2球蛋白、β1球蛋白、γ球蛋白結(jié)果與女性表面健康者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），α1球蛋白、β2球蛋白和β球蛋白結(jié)果2個(gè)組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。依據(jù)WS/T 402—2012[6]要求進(jìn)行Z檢驗(yàn)，白蛋白、α2球蛋白、β1球蛋白和γ球蛋白的計(jì)算Z值高于界值表Z*值，說(shuō)明男、女性之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。因此應(yīng)考慮按性別分組，建立不同的參考區(qū)間。

表1 不同性別表面健康者SPE結(jié)果比較 %，±s

表1 不同性別表面健康者SPE結(jié)果比較 %，±s

注：與男性比較，*P＜0.05。

性別 例數(shù) 白蛋白 α1球蛋白 α2球蛋白 β1球蛋白 β2球蛋白 γ球蛋白 β球蛋白男性 318 64.11±2.84 3.72±0.51 5.94±1.30 6.43±0.86 4.29±0.73 15.51±2.39 10.71±1.32女性 331 61.87±2.75* 3.80±0.57 6.74±1.23* 6.66±0.75* 4.22±0.65 16.72±2.37* 10.87±1.14合計(jì) 649 62.96±3.01 3.76±0.54 6.35±1.32 6.54±0.81 4.25±0.69 16.13±2.46 10.80±1.23

2.4 不同年齡表面健康者的SPE結(jié)果

男性18～29歲組、30～39歲組、40～49歲組、50～59歲組及≥60歲組之間白蛋白、α2球蛋白、β1球蛋白差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），α1球蛋白、β2球蛋白、γ球蛋白和β球蛋白差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩兩比較顯示，18～29歲組、30～39歲組、40～49歲組、50～59歲組白蛋白、α2球蛋白、β1球蛋白與≥60歲組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而18～29歲組、30～39歲組、40～49歲組、50～59歲組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），因此合并為19～59歲組。見(jiàn)表2。

表2 男性不同年齡表面健康者SPE結(jié)果比較 %，±s

表2 男性不同年齡表面健康者SPE結(jié)果比較 %，±s

注：與≥60歲組比較，*P＜0.05。

組別 例數(shù) 白蛋白 α1球蛋白 α2球蛋白 β1球蛋白 β2球蛋白 γ球蛋白 β球蛋白18～29歲組 63 64.54±2.94* 3.75±0.53 6.27±1.57* 6.15±0.93* 4.25±0.75 15.05±2.35 10.41±1.42 30～39歲組 113 64.32±2.55* 3.67±0.50 5.78±1.22* 6.36±0.88* 4.31±0.68 15.57±2.24 10.67±1.29 40～49歲組 74 64.06±3.04* 3.66±0.47 5.74±1.15* 6.61±0.81* 4.20±0.79 15.73±2.44 10.80±1.31 50～59歲組 46 63.91±2.40* 3.83±0.46 5.99±1.10* 6.60±0.68* 4.39±0.76 15.28±2.19 10.99±1.23≥60歲 22 62.43±3.60 3.85±0.65 6.42±1.51 6.60±0.81 4.37±0.63 16.33±3.27 10.97±1.24

女性18～29歲組、30～39歲組、40～49歲組、50～59歲組及≥60歲組之間白蛋白、β1球蛋白、β2球蛋白、β球蛋白差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），α1球蛋白、α2球蛋白和γ球蛋白差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩兩比較顯示，18～29歲組、30～39歲組、40～49歲組、50～59歲組白蛋白、β1球蛋白、β2球蛋白、β球蛋白與≥60歲組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而18～29歲組、30～39歲組、40～49歲組、50～59歲組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），因此合并為19～59歲組。見(jiàn)表3。

表3 女性不同年齡表面健康者SPE結(jié)果比較 %，±s

表3 女性不同年齡表面健康者SPE結(jié)果比較 %，±s

注：與≥60歲組比較，*P＜0.05。

組別 例數(shù) 白蛋白 α1球蛋白 α2球蛋白 β1球蛋白 β2球蛋白 γ球蛋白 β球蛋白18～29歲組 86 62.35±2.25* 3.79±0.54 6.83±1.18 6.49±0.78* 4.15±0.65* 16.39±2.01 10.65±1.21*30～39歲組 105 62.32±2.47* 3.76±0.58 6.62±1.18 6.58±0.74* 4.14±0.58* 16.58±2.30 10.72±1.07*40～49歲組 86 61.23±3.02* 3.85±0.59 6.63±1.21 6.85±0.78* 4.24±0.64* 17.20±2.34 11.09±1.10*50～59歲組 36 61.34±2.95* 3.73±0.52 6.88±1.34 6.74±0.58* 4.36±0.80* 16.95±3.17 11.10±1.16*≥60歲 18 61.03±2.68 3.96±0.56 7.30±1.43 6.76±0.60 4.60±0.67 16.35±2.59 11.36±1.05

采用LSD檢驗(yàn)和SNK檢驗(yàn)進(jìn)行比較，男性≥60歲組白蛋白低于19～59歲組（P＜0.05）；女性≥60歲組β2球蛋白、β球蛋白高于19～59歲組（P＜0.05）。依據(jù)WS/T 402—2012[6]要求進(jìn)行Z檢驗(yàn)，Alb、β2球蛋白、β球蛋白的計(jì)算Z值低于界值表Z*值，說(shuō)明≥60歲組與19～59歲組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此，可將19～59歲組與≥60歲組合并為一組，建立SPE的參考區(qū)間。見(jiàn)表4。

表4 不同性別、年齡表面健康者SPE結(jié)果比較 %，±s

表4 不同性別、年齡表面健康者SPE結(jié)果比較 %，±s

注：與同性別19～59歲組比較，*P＜0.05。

組別 例數(shù) 白蛋白 α1球蛋白 α2球蛋白 β1球蛋白 β2球蛋白 γ球蛋白 β球蛋白男性19～59歲組 296 64.23±2.74 3.71±0.49 5.91±1.28 6.41±0.86 4.28±0.74 15.45±2.31 10.70±1.32≥60歲組 22 62.43±3.60* 3.85±0.65 6.42±1.51 6.60±0.81 4.37±0.63 16.33±3.27 10.97±1.24女性18～59歲組 313 61.91±2.75 3.79±0.57 6.71±1.21 6.65±0.76 4.20±0.65 16.74±2.36 10.85±1.14≥60歲組 18 61.03±2.68 3.96±0.56 7.30±1.43 6.76±0.60 4.60±0.67* 16.35±2.59 11.36±1.05*

2.5 男、女性SPE的參考區(qū)間計(jì)算

采用正態(tài)分布法計(jì)算男性和女性表面健康者SPE的95%可信區(qū)間和99%可信區(qū)間，各項(xiàng)目的參考區(qū)間見(jiàn)表5。

表5 不同性別表面健康者SPE的參考區(qū)間 %

3 討論

CE是在傳統(tǒng)電泳基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新型分離技術(shù)，其中毛細(xì)管區(qū)帶電泳（capillary zone electrophoresis，CZE）（又稱自由溶液毛細(xì)管電泳），是CE最基本也是應(yīng)用最廣泛的一種分離方式。血清蛋白毛細(xì)管區(qū)帶電泳是近十幾年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的。由于不同的檢測(cè)系統(tǒng)之間采用的分離方法、電泳條件不盡相同，因此其檢測(cè)結(jié)果可能會(huì)存在一定的差異[7-8]，而且不同地區(qū)的檢測(cè)結(jié)果也可能存在一定的差異[9-10]，因此參考區(qū)間無(wú)法通用。

V8毛細(xì)管電泳儀的檢測(cè)原理為CZE，本研究擬初步建立V8毛細(xì)管電泳儀SPE的參考區(qū)間。生產(chǎn)廠商聲明的參考區(qū)間來(lái)自于美國(guó)人群，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證并不適用于本實(shí)驗(yàn)室?！度珖?guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第4版）給出的參考區(qū)間也引自試劑說(shuō)明書，也不適用于本實(shí)驗(yàn)室。

本研究結(jié)果顯示，男、女性SPE結(jié)果中白蛋白、α2球蛋白、β1球蛋白、γ球蛋白差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與文獻(xiàn)報(bào)道[2，7]（CAME和AGE）相符。另外，張海晨等[11]的研究結(jié)果顯示，男性溴甲酚綠化學(xué)法白蛋白的檢測(cè)結(jié)果高于女性（P＜0.05），化學(xué)法球蛋白檢測(cè)的結(jié)果低于女性（P＜0.05）。本研究結(jié)果顯示，按年齡分組，男性≥60歲組白蛋白結(jié)果與19～59歲組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；女性≥60歲組β2球蛋白、β球蛋白結(jié)果與19～59歲組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；隨著年齡的增長(zhǎng)，男、女性白蛋白結(jié)果均呈緩慢下降趨勢(shì)，與文獻(xiàn)報(bào)道[2，7]一致。依據(jù)WS/T 402—2012[6]要求進(jìn)行Z檢驗(yàn)，白蛋白、β2球蛋白、β球蛋白的計(jì)算Z值低于界值表Z*值，說(shuō)明≥60歲組與19～59歲組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

參考區(qū)間是否需要分組，不能單單考慮統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果，還應(yīng)根據(jù)不同檢驗(yàn)項(xiàng)目的臨床意義進(jìn)行判斷[6]。對(duì)于SPE而言，最重要的就是發(fā)現(xiàn)并定量單克隆蛋白質(zhì)，即M蛋白，許多疾病如B細(xì)胞淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、白血病、化學(xué)免疫抑制劑作用、原發(fā)性巨球蛋白血癥、重鏈病、輕鏈病、原發(fā)性淀粉樣變性、意義未明的單克隆免疫球蛋白血癥、多神經(jīng)病、皮膚黏液水腫樣苔蘚、多種慢性感染、結(jié)締組織病、非網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)腫瘤、脂肪代謝障礙、慢性肝病、病毒感染、藥物過(guò)敏、腫瘤、惡性淋巴瘤、自身免疫性疾病等均可能出現(xiàn)M蛋白[12]。另外，血清中多數(shù)有較高診斷意義的蛋白質(zhì)都微量存在，其濃度改變一般不會(huì)對(duì)其所在的電泳區(qū)帶產(chǎn)生明顯影響，但彌漫性肝損傷、肝硬化、原發(fā)性肝癌、腎病綜合征等肝、腎疾病患者以及慢性炎癥、妊娠、無(wú)丙種球蛋白血癥、雙白蛋白血癥患者的SPE結(jié)果可出現(xiàn)較明顯的改變?；赟PE在臨床中的價(jià)值，加上按年齡分層建立參考區(qū)間所需樣本量太大且在日常工作中的實(shí)用性又不強(qiáng)，因此本研究未按年齡建立V8毛細(xì)管電泳儀SPE的參考區(qū)間。雖然男、女性之間SPE結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但考慮到臨床應(yīng)用意義不大，且傳統(tǒng)的SPE檢測(cè)也未按性別分別建立參考區(qū)間，因此各臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況選擇按性別分組還是不分組。

綜上所述，本研究初步建立了V8毛細(xì)管電泳儀的SPE參考區(qū)間。但本研究仍有一定的局限性：（1）研究對(duì)象均來(lái)自同一家醫(yī)院，屬于單中心研究，代表性劣于隨機(jī)分層抽樣方式獲得的參考人群；（2）納入的研究對(duì)象年齡范圍較窄，缺乏18歲以下和78歲以上人群的數(shù)據(jù)，60歲以上人群的例數(shù)偏少，這可能會(huì)影響該年齡段人群結(jié)果的可信性；（3）未納入與經(jīng)典的AGE的比對(duì)結(jié)果。因此，本研究結(jié)果仍需要多中心、大樣本量的研究加以驗(yàn)證。