馮 惠，王曉輝，王 菊，馮長君

(徐州工程學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 徐州 221018)

氟喹諾酮藥物以喹啉-4-酮-3-羧酸為優(yōu)勢藥效團(tuán)的基本骨架，因其抗菌作用靶標(biāo)—拓?fù)洚悩?gòu)酶也是抗腫瘤藥物的重要作用靶點，由此可通過結(jié)構(gòu)修飾將其抗菌活性轉(zhuǎn)化為抗腫瘤活性. 胡國強(qiáng)等[1-2]課題組成功將氟喹諾酮C-3羧基被等排體如酰腙、唑雜環(huán)等所替代，可提高其抗腫瘤活性. 謝玉鎖等[3]利用藥效團(tuán)拼合原理，用均三唑雜環(huán)作為抗菌培氟沙星(Pefloxacin)C-3羧基的等排體，縮氨基硫脲作為等排體的優(yōu)化修飾基，成功合成12種培氟沙星C-3均三唑硫醚酮衍生物和12種培氟沙星C-3均三唑硫醚酮縮氨基硫脲衍生物，這24個化合物簡稱為“培氟沙星均三唑硫醚衍生物”. 他們采用MTT法測定了上述化合物對人白血病細(xì)胞(HL60)的體外抗增殖活性.

定量結(jié)構(gòu)?活性相關(guān) (Quantitative Structure-Activity Relationship, QSAR)[4-10]是基于分子結(jié)構(gòu)，運用數(shù)理及統(tǒng)計方法研究結(jié)構(gòu)與性能之間數(shù)量關(guān)系的學(xué)科. 徐光憲院士因其涉及化學(xué)的根本問題，曾稱其為21世紀(jì)化學(xué)的4個“世紀(jì)難題”之一. QSAR在預(yù)測化合物生物活性方面已成為化學(xué)、醫(yī)藥、環(huán)境等學(xué)科的熱門領(lǐng)域. 在3D-QSAR中最為常用的是1988年Crameretal提出的比較分子力場分析(Comparative Molecular Field Analysis， CoMFA)方法[11-18]，由于引入分子結(jié)構(gòu)的三維構(gòu)象信息，通常能夠獲得質(zhì)量更佳的QSAR模型. 本文基于CoMFA程序建立培氟沙星C-3均三唑硫醚衍生物對人白血病細(xì)胞(HL60)體外抗增殖活性(pM)[3]的3DQSAR模型，以揭示影響抗增殖活性的微觀結(jié)構(gòu)因素，探討抑制人白血病細(xì)胞(HL60)作用的分子機(jī)理.

1 研究對象

謝玉鎖等[3]合成的24種培氟沙星均三唑硫醚衍生物的分子基本結(jié)構(gòu)，見圖1. 其中取代基R、X見表1. 他們測定了上述化合物對人白血病細(xì)胞(HL60)的半數(shù)抑制濃度，以“IC50”表示，單位為μmol·L?1，其數(shù)值見表 1.

根據(jù)物理化學(xué)原理，化學(xué)反應(yīng)自由能變與體系平衡濃度為對數(shù)關(guān)系，故令：

24種合成化合物的pM數(shù)據(jù)見表1.

圖 1 培氟沙星均三唑硫醚衍生物分子的基本結(jié)構(gòu)Fig. 1 Basic structure of pefloxacin isotriazole sulfide derivative molecules

2 建模方法

使用Tripos公司Sybylx2.1.1分子模擬軟件建立培氟沙星均三唑硫醚衍生物對人白血病細(xì)胞(HL60)體外抗增殖活性的3D-QSAR模型，使用的模塊包括 SYBYL、Sketch、Minimize、Databasealignment以及CoMFA的QSAR方法等.

2.1 化合物分子藥效構(gòu)象的確定及分子疊合一般采用分子能量最低的構(gòu)象代替藥效活性構(gòu)象. 使用 Sybylx2.1.1軟件中的 Sketch molecule模塊，先構(gòu)建24個培氟沙星均三唑硫醚衍生物分子[3]和新設(shè)計5個分子的初始三維結(jié)構(gòu)；再通過Minimize模塊及Tripos力場，加Gasteiger-Huckel電荷以及把最大迭代次數(shù) (Max. Iterations)定為 1 000 等設(shè)置，對所有分子進(jìn)行分子力學(xué)能量最低優(yōu)化. 通過全構(gòu)象搜索得到能量最低構(gòu)象，并以此最低能量構(gòu)象作為分子疊合的生物活性構(gòu)象.

隨機(jī)選取分子3、9、16、22、23為測試集(Test set；含 22 號模板分子. 見表 1 中帶“*”的分子)，余下20個分子作為訓(xùn)練集(Training set，亦含22號分子). 所謂模板分子是指樣本中生物活性最強(qiáng)的分子. 以對HL60細(xì)胞體外抗增殖活性最強(qiáng)的22號為模板分子，基于原子契合的公共骨架疊合方式(即盡量保證所有疊合分子取向相同，使分子間相互重疊誤差最小)予以疊合. 即以22號分子中的公共骨架，運用Align database模塊對訓(xùn)練集、測試集分別進(jìn)行疊合. 此二集的疊合圖見圖2，分子間密切重合，疊合效果良好.

2.2 CoMFA 模型的建立采用 Tripos標(biāo)準(zhǔn)力場，對訓(xùn)練集的疊合分子周圍每個網(wǎng)格點上的立體場(Steric，St)及靜電場 (Electrostatic，El)予以計算場能值. 以體外抗增殖活性為因變量，場能值為自變量，用偏最小二乘法 (Partial Least Squares，PLS)進(jìn)行建模. 首先采用逐一剔除法 (Leave-One-Out，LOO)進(jìn)行交叉驗證，以獲交叉驗證系數(shù)和最佳主成分?jǐn)?shù)N. 一是以衡量模型的預(yù)測能力，要求的模型，其可信度優(yōu)于95%，或然性小于5%；的模型，統(tǒng)計意義十分顯著[19].二是以最佳主成分?jǐn)?shù)N建立非交叉QSAR模型，獲得判定系數(shù)R2、估計標(biāo)準(zhǔn)誤差SD、統(tǒng)計方差比F. 最后采用View CoMFA模塊，以三維等勢圖直觀反映立體場和靜電場對培氟沙星均三唑硫醚衍生物pM的貢獻(xiàn).

表 1 培氟沙星均三唑硫醚衍生物分子結(jié)構(gòu)與抗增殖活性(pM)Tab. 1 The molecular structures and anti-liver cancer activity(pM) of pefloxacin isotriazole sulfide derivatives

圖 2 訓(xùn)練集與測試集的疊合圖Fig. 2 The plots of all the aligned molecules in training set(a)and test set(b)

3 結(jié)果與討論

3.1 訓(xùn)練集 pM的 CoMFA模型培氟沙星均三唑硫醚衍生物對HL60細(xì)胞體外抗增殖活性pM的3D-QSAR模型見表2，St.、Ele.分別代表立體場及靜電場對pM的貢獻(xiàn)率.

表 2 訓(xùn)練集 pM的 CoMFA 模型Tab. 2 The CoMFA model of training set for pM

模型質(zhì)量檢驗如下：

(2) 非交叉驗證部分：①判定系數(shù)檢驗. 根據(jù)一般的統(tǒng)計標(biāo)準(zhǔn), 若要建立一個具有良好擬合性的QSAR 模型，其R2≥0.80[20]. 本研究R2=0.903＞0.80，顯示良好的相關(guān)性. 由于R2又稱為削減誤差比例，即該模型包含了影響pM的90.3%以上因素，尚有不足9.7%歸于隨機(jī)因素，故可用于pM的估算與預(yù)測. ②顯著性檢驗. 在95%顯著水平下，訓(xùn)練集CoMFA模型的F臨界值為F0.05(4,15)=3.06. 所建模型的F是其11倍之多，表明模型規(guī)定的因果關(guān)系顯著.

(3)外部預(yù)測能力：利用訓(xùn)練集的3D-QSAR模型對測試集中分子的pM進(jìn)行預(yù)測，以檢驗其外部預(yù)測能力. 對pM的預(yù)測值見表1，平均絕對預(yù)測誤差僅為0.152，與相應(yīng)實驗值非常吻合，呈現(xiàn)模型很好的外部預(yù)測能力.

3.2 訓(xùn)練集 CoMFA 等勢圖CoMFA 模型的三維等勢圖分為立體作用分布圖和靜電作用分布圖.

以化合物22為模板分子的pM的三維立體場等勢圖見圖3(a). 在縮氨基硫脲部位有2個綠色區(qū)域，該區(qū)域引入體積較大的取代基有助于提高化合物的抗增殖活性. 因此，1～12號化合物沒有縮氨基硫脲部分，其抗增殖活性都弱于相應(yīng)13～24化合物. 另外，在苯環(huán)的3,4-位之間有個黃色區(qū)域，該區(qū)域引入體積小的基團(tuán)會使化合物的抗增殖活性增強(qiáng). 例如 6、18 的 3,4-位為 OCH2，7、19 的 3,4-位為CH3O，其抗增殖活性均比2～5、14～17弱.

以化合物22為模板分子的pM的三維靜電場等勢圖見圖3(b). 在縮氨基硫脲部位有個靠近氨基中氫原子較大的藍(lán)色區(qū)域，以及靠近硫原子較小的藍(lán)色區(qū)域. 在此區(qū)域引入正電性基團(tuán)利于生物活性最強(qiáng). 因此，后12個化合物的抗增殖活性都強(qiáng)于(相應(yīng))前12個化合物. 在苯環(huán)的3,4-位之間有個紅色區(qū)域，此區(qū)域處引入負(fù)電性取代基有助于增強(qiáng)化合物的生物活性. 例如4-位上氟原子是最強(qiáng)的負(fù)電性基團(tuán)，故10號在前12個化合物中、22號在后12個化合物均有最強(qiáng)的抗增殖活性.

圖 3 CoMFA 模型的立體場與靜電場等勢圖Fig. 3 CoMFA contour maps. (a) steric field; (b) electrostatic field

此模型顯示立體場和靜電場對pM的貢獻(xiàn)分別為71.8%和28.2%，可見取代基的立體作用強(qiáng)于靜電作用2倍多. 即pM主要取決于取代基的立體場，即3,4-位引入小體積基團(tuán)的分子，與靶標(biāo)生物大分子提供的空穴很好契合，空間位阻小而利于提高對HL60細(xì)胞體外抗增殖活性. 其靜電作用一般包含庫侖力、氫鍵及配位. 3,4-位上體積較小的負(fù)電性基團(tuán)F具備與靶標(biāo)形成庫侖力、氫鍵及配位的必備條件，因此，10號分子在前12個分子、22號在后12個分子中均是最強(qiáng)的抗增殖活性.

3.3 分子設(shè)計 QSAR研究目的之一是根據(jù)所建模型中隱含的影響生物活性的主要結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行分子設(shè)計. 由3.2節(jié)分析可知，在苯環(huán)的3,4-位上引入小體積的負(fù)電性基團(tuán)，有利于增強(qiáng)培氟沙星均三唑硫醚衍生物對HL60細(xì)胞體外抗增殖活性. 據(jù)此設(shè)計5個化合物(見表1中第25～29號化合物)，3D-QSAR模型給出的pM預(yù)測值在5.322～5.519之間，均優(yōu)于22號分子預(yù)測值(5.149).

4 結(jié)論

(1) 基于比較分子力場方法(CoMFA)建立培氟沙星均三唑硫醚衍生物對人白血病細(xì)胞(HL60)體外抗增殖活性的 3D-QSAR 模型：= 0.436，R2= 0.903，F(xiàn)=34.89，顯示優(yōu)良的魯棒性、擬合性和預(yù)測能力.

(2) CoMFA模型三維等勢圖顯示在苯環(huán)的3,4-位上引入小體積的負(fù)電性基團(tuán)，有利于增強(qiáng)培氟沙星均三唑硫醚衍生物對HL60細(xì)胞的抗增殖活性.據(jù)此設(shè)計的5個化合物，顯示較大的pM預(yù)測值，有待生物醫(yī)學(xué)實驗確認(rèn).