黃躍平 姚 琴 歐陽夏荔 劉津藝 惠 鑫 王 昊 和 蕊 張 瑞 趙百孝

（北京中醫(yī)藥大學，北京 102488）

動脈粥樣硬化（AS）是缺血性心腦血管疾病的主要病理基礎［1］。中醫(yī)認為AS是因臟腑功能失調，釀生痰濁血瘀結于脈絡導致痹阻不通。艾灸溫通經脈、行氣活血的功效與AS的病機高度契合。其起效因素包括熱效應、艾煙等，可調控AS炎性反應以延緩AS病理進程［2］。本實驗采用不同處理方式艾燃燒生成物（Moxa combustion products，MCP）干預動脈粥樣硬化小鼠，進一步挖掘抗AS的相關作用成分。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用8周齡雄性ApoE-/-小鼠為AS模型，同齡相同遺傳背景雄性非轉基因C57BL/6小鼠為空白對照，均購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2016-0006?？瞻捉M采用常規(guī)飼料喂養(yǎng)，其余采用高脂飼料喂養(yǎng)（北京維通利華實驗動物有限公司，含15%豬油、2%膽固醇、0.05%膽酸），所有小鼠自由進食飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度（22±2）℃，相對濕度50%～60%，人工控制室內照明，保持12 h光照（8∶00～20∶00）和12 h黑暗（20∶00～次日8∶00）交替循環(huán)。

1.2 試藥與儀器 3年陳艾絨（規(guī)格：20 mm×200 mm）及三年陳艾葉精油（規(guī)格：500 mL/瓶），購自李時珍醫(yī)藥集團有限公司。自制小鼠圓筒網(wǎng)狀固定器（規(guī)格：長90 mm，直徑50 mm）；動式染毒柜（型號：HOPE-MED 8050，天津開發(fā)區(qū)合普工貿有限公司）；燃燒爐（自制）；P5L2C光散射式微電腦數(shù)字粉塵測試儀（北京賓達綠創(chuàng)科技有限公司）；Whatman劍橋濾片F(xiàn)319-04（直徑92 mm），賽譜銳思（北京）科技有限公司生產；魚躍超聲霧化器（型號：402AI，江蘇魚躍醫(yī)療設備股份有限公司）；干擾素-γ（INF-γ）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒；白細胞介素-10（IL-10）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒；基質金屬蛋白酶9（MMP-9）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒；基質金屬蛋白酶抑制劑1（TIMP-1）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒，北京瑞格博科技發(fā)展有限公司生產。

1.3 分組方法 40只雄性ApoE-/-小鼠采用隨機數(shù)字表法分為5組（每組8只）：艾煙組、濾過艾煙組、艾絨揮發(fā)物組、艾葉精油組、模型組。8只相同遺傳背景同齡的雄性C57BL/6非轉基因小鼠作為空白對照。各組小鼠適應性喂養(yǎng)1周后進行干預。

1.4 干預方法 1）空白組及模型組：均每日抓取、固定，將小鼠置于無艾煙染毒柜中，每日20 min，每周6 d。2）艾煙組：燃燒爐（與染毒柜相連）中點燃三年陳艾絨1.5 g，艾煙經管道導入染毒艙，流量根據(jù)預設遮光率全自動調控；艾煙濃度達到10 mg/m3～15 mg/m3之間時，染毒柜遮光率為2%左右［3］，20 min約燃燒3年陳艾絨1.5 g。3）濾過艾煙組：染毒艙艾煙入口處安裝Whatman劍橋濾片以截留顆粒物［4］，艾煙生成同上。4）艾絨揮發(fā)物組：將艾絨平鋪于玻璃管內，調設150℃對環(huán)形加熱器預熱，待各項參數(shù)穩(wěn)定后，啟動環(huán)形加熱器對玻璃管進行恒溫勻速移動加熱，所用陳艾絨質量與艾煙組相等。5）艾葉精油組：取3.75 μL艾葉精油（1.5 g艾絨所含揮發(fā)油含量折合），霧化器中加入16 mL蒸餾水，并連接于染毒艙玻璃入口，霧化速度為0.8 mL/min［5］。干預組每日抓取、固定，將小鼠置于不同處理方式艾燃燒生成物濃度的染毒柜中，每日20 min，每周6 d。各組每天干預結束后，清洗染毒柜。所有組別均干預觀察14周。

1.5 標本采集與檢測 末次干預后，禁食不禁水12 h。小鼠麻醉后，眼眶靜脈叢采集血液標本約1.5～2 mL，置于肝素鈉抗凝采血管中，輕輕顛倒混勻，離心15 min（4℃ 3 500 r/min），之后置于-20℃冰箱中備用。采用INF-γ、IL-10、MMP-9、TIMP-1 ELISA試劑盒檢測相應指標。每組隨機選取6只小鼠，取出主動脈放入4%多聚甲醛固定，用于HE染色觀察病理變化。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS25.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，若符合正態(tài)分布且方差齊，使用單因素方差分析，再使用LSD進行組間多重比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠胸主動脈病理形態(tài) 見圖1。正常組小鼠主動脈管腔大小正常，內皮細胞完整，未見AS斑塊形成。模型組小鼠主動脈管腔明顯狹窄，內皮細胞破裂，內膜及中膜明顯增厚，彈力纖維斷裂，有明顯斑塊形成，斑塊內可見較多脂肪滴。艾煙組小鼠主動脈管腔大小正常，少量內皮細胞被破壞，彈力纖維少量斷裂，較模型組顯著改善。濾過艾煙組小鼠主動脈管腔輕度狹窄，少量內皮細胞被破壞，少量纖維斑塊形成，較模型組顯著改善。艾絨揮發(fā)組小鼠主動脈管腔輕度狹窄，彈力纖維少量斷裂，少量脂質浸潤，較模型組有改善。艾葉精油組小鼠主動脈管腔明顯狹窄，內皮細胞明顯破壞，中膜增厚，彈力纖維斷裂，粥樣硬化斑塊形成且可見較多脂肪浸潤，與模型組無顯著差異。

圖1 各組小鼠胸主動脈病理（HE染色，20倍）

2.2 各組小鼠血清INF-γ含量比較 見表1。與空白組相比，模型組血清INF-γ含量顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，艾煙組、濾過艾煙組、艾絨揮發(fā)組血清INF-γ含量均顯著降低（P＜0.05）；艾葉精油組與模型組比較無顯著差異（P＞0.05）。各干預組組間比較無顯著差異（P＞0.05）。

2.3 各組小鼠血清IL-10含量比較 見表1。與空白組相比，模型組血清IL-10含量顯著下降（P＜0.01）。與模型組相比，艾煙組、濾過艾煙組血清IL-10含量均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；其余兩組與模型組比較無顯著差異（P＞0.05）。不同干預方式組組間比較：艾煙組血清IL-10含量顯著高于艾絨揮發(fā)組和艾葉精油組（P＜0.05），其余組間比較無顯著差異（P＞0.05）。

表1 各組小鼠血清中INF-γ、IL-10及INF-γ/IL-10比較（±s）

表1 各組小鼠血清中INF-γ、IL-10及INF-γ/IL-10比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與艾煙組比較，#P＜0.05。下同。

組別空白組模型組艾煙組濾過艾煙組艾絨揮發(fā)組艾葉精油組n 8 8 8 8 8 8 INF-γ（ng/L）65.88±13.56**100.33±23.07 70.38±22.97*72.31±17.70*74.33±25.85*90.42±31.64 IL-10（ng/L）98.81±14.87**51.26±14.31 95.33±30.36**77.34±14.14*62.48±22.34#69.45±24.68#INF-γ/IL-10（Th1/Th2）0.67±0.10**1.98±0.17 0.73±0.16**0.93±0.11**1.19±0.09#1.37±0.33#

2.4. 各組小鼠INF-γ/IL-10比較 見表1。與空白組相比，模型組INF-γ/IL-10比值顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，艾煙組、濾過艾煙組INF-γ/IL-10比值均顯著降低（P＜0.01）；其余兩組與模型組比較無顯著差異（P＞0.05）。不同干預方式組組間比較：艾煙組INF-γ/IL-10比值顯著低于艾絨揮發(fā)組和艾葉精油組（P＜0.05），其余組間比較無顯著差異（P＞0.05）。

2.5 各組小鼠血清MMP-9、TIMP-1含量比較 見表2。與空白組相比，模型組小鼠血清MMP-9含量顯著升高（P＞0.05），TIMP-1含量無顯著差異（P＞0.05）。與模型組相比，艾煙組、濾過艾煙組、艾絨揮發(fā)組MMP-9含量顯著降低（P＜0.05），艾葉精油組無顯著差異（P＜0.05），艾煙組TIMP-1含量顯著升高（P＜0.05），其余3組無顯著差異（P＞0.05）。不同干預方式組組間比較：艾煙組、濾過艾煙組、艾絨揮發(fā)組MMP-9均顯著低于艾葉精油組（P＜0.05），其余組間無顯著差異（P＞0.05）；而艾煙組TIMP-1顯著高于艾絨揮發(fā)組、艾葉精油組（P＜0.01），濾過艾煙組TIMP-1顯著高于艾葉精油組（P＜0.01），其余組間比較無顯著差異（P＞0.05）。

表2 各組小鼠血清中MMP-9、TIMP-1含量比較（ng/mL，±s）

表2 各組小鼠血清中MMP-9、TIMP-1含量比較（ng/mL，±s）

注：與艾葉精油組比較，△P＜0.05。

組別空白組模型組艾煙組濾過艾煙組艾絨揮發(fā)組艾葉精油組n 8 8 8 8 8 8 MMP-9 22.06±2.36**38.07±9.66 22.20±6.73**△23.21±5.93*△22.40±5.57*△33.81±4.65 TIMP-1 124.28±15.42 130.63±15.10 174.62±15.87*155.60±21.46△137.91±17.04#130.78±20.59#

3 討 論

濾過艾煙組采用劍橋濾片進行濾過艾煙，其顆粒物的截留率高達97.8%以上［4］，旨在觀察濾過艾煙的成分是否為抗AS的起效因素。艾絨揮發(fā)組采用環(huán)形加熱器加熱艾絨而不使其燃燒，旨在觀察艾煙（有燃燒過程）和艾絨揮發(fā)（無燃燒過程）抗AS療效比較，以探索艾灸燃燒過程對于艾灸的必要性及重要性。艾葉精油組設置意義在于比較艾燃燒時所產生的揮發(fā)油及其他成分（艾煙）與僅用揮發(fā)油（艾葉精油）在抗AS的療效，探索艾燃燒生成物相關有效成分抗AS的量效關系。本實驗創(chuàng)新性設計出4種不同處理方式艾燃燒生成物干預AS的方法，以期闡明艾煙起效的相關性成分。

動脈粥樣硬化斑塊處存在大量的CD4+T細胞［6］。其中Th1細胞主要分泌促炎因子INF-γ具有致AS的作用，Th2細胞主要分泌抑炎性因子IL-10具有抗AS的作用［7］。炎性細胞在促炎因子作用下，分泌基質金屬蛋白酶（MMP）降解纖維帽中膠原纖維，增加斑塊不穩(wěn)定性［8］。本研究選取炎癥免疫反應中促炎因子INF-γ、抑炎因子IL-10以及影響斑塊穩(wěn)定性的MMP-9、TIMP-1，以闡明不同處理方式艾燃燒生成物對AS炎癥反應及斑塊穩(wěn)定性的作用機制。

INF-γ能激發(fā)炎癥反應，并促進MMP產生，最終造成斑塊脫落［9］。此外，IFN-γ通過抑制血管損傷處平滑肌細胞增殖、收縮及膠原分泌，引起纖維帽變薄造成斑塊不穩(wěn)定［10］。IL-10可減輕血管內膜局部的炎癥反應，降低炎性因子對平滑肌細胞的刺激作用［11］。此外，IL-10通過抗凋亡機制抑制泡沫細胞凋亡，并減少斑塊中MMP的活性以增加斑塊穩(wěn)定性［12］。MMP-9是降解Ⅳ、Ⅴ型膠原和明膠最主要成員之一［13］，加速了動脈粥樣硬化的進程及斑塊的破裂［14］。而血清TIMP-1是MMP-9的內源性抑制物，對由MMP-9產生的基質降解起重要的平衡作用［15］。TIMP-1能減少斑塊破裂的風險，起到穩(wěn)定斑塊的作用［16］。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，ApoE-/-小鼠經高脂飼料喂養(yǎng)14周后其血清INF-γ、MMP-9含量升高，IL-10含量降低，說明ApoE-/-小鼠血管內存在炎癥反應，并提示粥樣斑塊內不穩(wěn)定性增加。經艾煙及濾過艾煙干預14周后，ApoE-/-小鼠血清中INF-γ、MMP-9含量顯著降低，IL-10、TIMP-1含量顯著升高，說明艾煙或濾過艾煙可通過調控炎癥反應，促進MMP-9與TIMP-1之間的動態(tài)平衡以增強斑塊穩(wěn)定性，從而減緩AS的發(fā)展，提示艾煙及濾過艾煙在一定程度上效用相近，說明艾煙中的顆粒物成分可能不是艾灸起效的關鍵因素，這對于臨床上使用隔煙罩濾過艾煙施灸，即能保證臨床療效，又可減少患者對艾煙顆粒物安全性的疑慮具有指導性價值。而與模型組相比，艾絨揮發(fā)組血清中IL-10、TIMP-1含量無顯著性差異，艾葉精油清中INF-γ、IL-10、MMP-9、TIMP-1含量均無顯著性差異，一方面提示艾絨燃燒時氧化或熱解生成的新物質可能是艾灸起效的關鍵成分，另一方面提示艾灸抗AS起效的關鍵在于艾絨加熱揮發(fā)、熱解、燃燒過程產生的物質。艾煙與濾過艾煙在改善AS炎癥及增強斑塊穩(wěn)定性有一定療效，可能與相應的炎性通路有關，進一步研究將在后續(xù)展開。