蔣彤，呂新林，凌華山，陳斌，田潘婷，朱晶晶*，王智民*，劉志高，劉繼延

（1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，中藥質(zhì)量控制技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100700；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 301617；3.江西齊云山食品有限公司，江西 贛州 341000）

南酸棗 [Choerospondias axillaris（Roxb.）Burtt et Hill]，屬無(wú)患子目漆樹(shù)科南酸棗屬植物。主要分布在我國(guó)的暖溫帶省區(qū)，日本、印度等國(guó)家也有分布。南酸棗具有悠久的藥用和食用傳統(tǒng)，屬藥食兩用植物[1]。南酸棗以干燥成熟果實(shí)入藥，是藏藥和蒙藥醫(yī)治心病的常用藥材之一[1]。2015年版《中國(guó)藥典》記載南酸棗能行氣活血，養(yǎng)心安神，常用于氣滯血瘀，胸痹作痛，心悸氣短，心神不安[2]。近年來(lái)中藥產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展，推動(dòng)了南酸棗在食品領(lǐng)域的廣泛開(kāi)發(fā)利用，南酸棗果肉被開(kāi)發(fā)為南酸棗糕，對(duì)食欲不振、厭食和食滯腹痛有良好的輔助作用，日益受到消費(fèi)者的青睞[3]。但在南酸棗糕產(chǎn)品加工過(guò)程中，產(chǎn)生了占加工總量30%的南酸棗皮副產(chǎn)物，造成巨大資源浪費(fèi)的同時(shí)也帶來(lái)了環(huán)境污染問(wèn)題。研究表明，南酸棗皮富含豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)，如原花青素、黃酮、酚酸、多種維生素、有機(jī)酸、多糖、膳食纖維和礦物元素[1]。南酸棗皮原花青素具有抗氧化、抗結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、降血糖等生物活性[1，4-5]。南酸棗總黃酮可以防治心腦血管疾病，保護(hù)大鼠心肌缺血，對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠心率失常有拮抗作用[1，6]。將南酸棗皮添加到壓縮食品中，在增加壓縮食品營(yíng)養(yǎng)成分的同時(shí)，還能促進(jìn)淀粉的消化[7]。

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人民生活水平提高，果酒已深受消費(fèi)者青睞。以南酸棗皮為原料經(jīng)發(fā)酵加工而成的純天然南酸棗皮果酒，不但風(fēng)味獨(dú)特，酯香醇厚，還具有一定的保健功能。本研究在明確南酸棗皮果酒化學(xué)成分的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開(kāi)展抗氧化及抑制α-葡萄糖苷酶活性研究，以期充分利用南酸棗皮副產(chǎn)物開(kāi)發(fā)高值化附加產(chǎn)品，為南酸棗果皮綜合利用和南酸棗皮果酒等相關(guān)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮南酸棗由江西齊云山食品有限公司提供；釀酒酵母WLP775：美國(guó)White Labs公司；白砂糖：市售；蒸餾水：廣州屈臣氏公司；乙腈（色譜純）：美國(guó)Fisher公司；甲酸（質(zhì)譜級(jí)）：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；十二水合磷酸氫二鈉、無(wú)水碳酸鈉、鹽酸、香草醛、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、九水硝酸鋁（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；十二水合磷酸二氫鈉、甲醇（分析純）：北京化工廠；檸檬酸（批號(hào)171130-03）：成都普思生物科技有限公司；原花青素B2（批號(hào)CHB170225）、兒茶素（批號(hào)CHB170313）、維生素 C（批號(hào) CHB171011）、綠原酸（批號(hào)CHB160418）：成都克洛瑪生物科技有限公司，純度均＞98%；槲皮苷（純度≥98%，批號(hào) 111538-200403）、沒(méi)食子酸（C7H6O5含量為90.1%，批號(hào)110831-200803）：中國(guó)食品藥品檢定研究院；DPPH：北京Coolaber科技有限公司；果膠酶（酶活500 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司；α-葡萄糖苷酶（液體，酶活≥70萬(wàn)U/mL）、對(duì)硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷、阿卡波糖、蘆?。ㄅ?hào)Y06J8S37439，純度≥98%）：上海源葉生物科技有限公司；福林酚試劑：北京索萊寶科技有限公司；SO2氣體：天津環(huán)達(dá)亞氣體公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITYUPLC超高效液相色譜儀、XevoG2-SQTof質(zhì)譜儀、ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱：美國(guó) Waters公司；XSE 105DU 分析天平：梅特勒-托利多；THZ-98A恒溫振蕩器：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Multiscan FC酶標(biāo)儀：賽默飛世爾科技公司；T6新世紀(jì)紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 南酸棗皮果酒的釀造

1.3.1.1 釀造工藝流程

南酸棗皮果酒制備工藝流程：南酸棗清洗→南酸棗漂燙滅菌→瀝干→剝皮→破碎→滅菌→果膠酶和50 mg/LSO2處理→接種加料→主發(fā)酵→過(guò)濾去渣→后發(fā)酵→過(guò)濾→陳釀→過(guò)濾→滅菌裝罐[8-9]。

1.3.1.2 操作要點(diǎn)

南酸棗以成熟無(wú)腐爛變質(zhì)的果實(shí)為佳，洗凈后在95℃左右的熱水中漂燙2 min～3 min，既利于皮肉分離和破碎加工，又可以抑制果實(shí)中的多酚氧化酶活性，抑制氧化；將南酸棗皮破碎，過(guò)濾得到果汁；果汁進(jìn)行高溫瞬時(shí)滅菌，120℃條件下加熱15 s后迅速冷卻，以免果汁的營(yíng)養(yǎng)成分被高溫破壞，添加0.5%果膠酶，40℃酶解2 h，提高出汁率，裝罐前用SO2熏罐，并加入50 mg/L的SO2；酵母使用前要進(jìn)行復(fù)水活化，將干酵母加入38℃含糖量5%的糖水，攪拌溶解，15 min～30 min后冷卻至28℃～30℃與處理好的南酸棗皮汁混合均勻，酵母接種質(zhì)量為原汁質(zhì)量的0.03%～0.05%，發(fā)酵罐在25℃～28℃條件下密閉發(fā)酵4 d～5 d，用經(jīng)巴氏滅菌的紗布過(guò)濾得汁液；將果酒液裝入不銹鋼罐中，用蓋密封，放置在17℃～19℃下，后發(fā)酵1個(gè)月；后發(fā)酵的酒液用多層滅菌紗布再次過(guò)濾于不銹鋼罐中，最后在低溫12℃～15℃，濕度70%，沒(méi)有強(qiáng)光照射的清潔環(huán)境下陳釀2個(gè)月；采用有機(jī)陶瓷膜設(shè)備過(guò)濾，滅菌、裝罐。

1.3.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) （liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS）檢測(cè)

1.3.2.1 對(duì)照品溶液制備

分別精密稱(chēng)取沒(méi)食子酸、原花青素B2、兒茶素、檸檬酸、綠原酸、槲皮苷對(duì)照品5 mg，分別置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度。

1.3.2.2 供試品溶液的制備

取南酸棗皮果酒樣品，12 000 r/min離心20 min，取上清液備用。

1.3.2.3 色譜條件和質(zhì)譜條件

色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱，乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）梯度洗脫，洗脫程序：0～8.34 min，2%～12%A；8.34 min～13.55 min，12% ～19%A；13.55 min～20.84 min，19% ～70%A；20.84 min～25.01 min，70%～100%A；25.01 min～26 min，100%A；柱溫 35 ℃，體積流量 0.4 mL/min，進(jìn)樣量 2 μL，檢測(cè)波長(zhǎng) 200 nm～700 nm。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正負(fù)離子模式掃描，離子源溫度120℃，霧化氣為N2，質(zhì)量掃描范圍m/z 100～2000，累積時(shí)間0.2s，錐孔電壓40V，毛細(xì)管電壓2kV，碎片離子碰撞能量20 eV～50 eV，母離子碰撞能量6 eV，脫溶劑氣流速600 L/h，錐孔氣體流量50 L/h，脫溶劑氣溫度400℃，數(shù)據(jù)的采集和處理軟件為Mass Lynx 4.1質(zhì)譜工作站。

1.3.3 南酸棗皮果酒中總黃酮、總原花青素和總酚的含量測(cè)定

1.3.3.1 南酸棗皮果酒中總黃酮的含量測(cè)定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法[10]進(jìn)行南酸棗皮果酒中總黃酮的含量測(cè)定。取100 μL南酸棗皮果酒置于25 mL容量瓶中，加70%乙醇至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置 6 min，加 NaOH 溶液 10 mL，再加70%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min。以未加標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為空白，在500 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=11.023x-0.029 9，R2=0.999，總黃酮含量以每毫升南酸棗皮果酒所含蘆丁質(zhì)量表示。

1.3.3.2 南酸棗皮果酒中總原花青素的含量測(cè)定

采用香草醛-鹽酸法[11]測(cè)定南酸棗皮果酒中總原花青素的含量。分別吸取50 μL南酸棗皮果酒至10 mL試管中，用甲醇稀釋至1 mL，再向其中加入6 mL濃度為0.04 g/mL的香草醛甲醇溶液和3 mL濃鹽酸，定容，混勻，在25℃下避光反應(yīng)30 min后，用甲醇代替標(biāo)準(zhǔn)品作空白對(duì)照，于500 nm處測(cè)定吸光度。以?xún)翰杷貫闃?biāo)準(zhǔn)品得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=3.085 4x+0.052 1，R2=0.999，總原花青素含量以每毫升南酸棗皮果酒所含兒茶素質(zhì)量表示。

1.3.3.3 南酸棗皮果酒中總酚的含量測(cè)定

采用福林酚法[12]測(cè)定南酸棗皮果酒中總酚含量。精密量取50 μL南酸棗皮果酒置于25 mL棕色量瓶中，加入福林酚試液1 mL，再加水11.95 mL，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min，以相應(yīng)的試劑為空白，在760 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以沒(méi)食子酸為對(duì)照品得到回歸方程為y=107.55x+0.063 7，R2=0.999 9?？偡淤|(zhì)量濃度以每毫升南酸棗皮果酒所含沒(méi)食子酸質(zhì)量表示。

1.4 南酸棗皮果酒抑制α-葡萄糖苷酶活性

α-葡萄糖苷酶可使淀粉水解為葡萄糖，其抑制劑與小腸中的α-葡萄糖苷酶競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，使淀粉水解的速度減緩，降低血糖[13]。α-葡萄糖苷酶可使對(duì)硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG）產(chǎn)生對(duì)硝基苯酚，于堿性溶液中呈鮮黃色。將南酸棗皮果酒凍干得到南酸棗皮果酒粉末，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）配成不同濃度的溶液。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定生成的對(duì)硝基苯酚的含量可以計(jì)算樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率[14]。于96孔板中加入50 μL不同濃度的樣品溶液或/和50 μL 280 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，在37℃恒溫振蕩器中孵育10 min后，加入50 μL 4 mmol/L的pNPG溶液開(kāi)始反應(yīng)，于405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值記為A樣品；用pH 6.8的磷酸鹽緩沖液代替樣品溶液，于405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值記為A陰性對(duì)照，陰性對(duì)照顯示鮮黃色，提示反應(yīng)終點(diǎn)。加入50 μL 0.2 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)。本試驗(yàn)以阿卡波糖為陽(yáng)性藥，平行3個(gè)復(fù)孔，按公式（1）計(jì)算抑制率。

1.5 南酸棗皮果酒DPPH自由基清除能力

參考文獻(xiàn)[15-17]中DPPH法并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。將南酸棗皮果酒凍干得到南酸棗皮果酒粉末，用乙醇配制成不同濃度的樣品溶液。用無(wú)水乙醇配制0.2 mmol/L DPPH溶液。在比色管中加入2 mL DPPH溶液和1 mL樣品溶液，避光反應(yīng)30 min，在515 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，記為Ai；2 mL DPPH和1 mL無(wú)水乙醇的吸光度值記為Ac；2 mL無(wú)水乙醇和1 mL樣品溶液的吸光度值記為Aj；3 mL無(wú)水乙醇作為空白對(duì)照；維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)3次。按公式（2）計(jì)算DPPH自由基清除率。

1.6 數(shù)據(jù)處理

質(zhì)譜分析采用Mass Lynx 4.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集及分析；抗氧化和降血糖活性的測(cè)定采用SPSS 21.0數(shù)據(jù)處理軟件計(jì)算IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 南酸棗皮果酒的化學(xué)成分研究

2.1.1 南酸棗皮果酒的色譜峰指認(rèn)

通過(guò)與對(duì)照品的LC-MS/MS數(shù)據(jù)比對(duì)，并結(jié)合文獻(xiàn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，總結(jié)質(zhì)譜指認(rèn)結(jié)果，從南酸棗皮果酒中共指認(rèn)了34個(gè)化合物，其中黃酮類(lèi)化合物18個(gè)，有機(jī)酸類(lèi)化合物11個(gè)，酯類(lèi)化合物5個(gè)，此外還有3個(gè)未知化合物，結(jié)果見(jiàn)圖1和表1。

2.1.2 南酸棗皮果酒中總黃酮、總原花青素和總酚的含量測(cè)定結(jié)果

根據(jù)質(zhì)譜定性分析結(jié)果，南酸棗皮果酒含有豐富的生物活性成分，進(jìn)一步采用紫外分光光度法對(duì)南酸棗皮果酒中的總黃酮、總原花青素和總酚進(jìn)行定量分析的結(jié)果見(jiàn)表2。

如表2所示，南酸棗皮果酒富含豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)，如原花青素、黃酮和多酚。其中總黃酮含量最高，可達(dá)到15.239mg/mL；總酚含量為7.595mg/mL；總原花青素含量為4.015 mg/mL。有研究表明，南酸棗皮中的生物活性成分具有良好的抗氧化、抗結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、降血糖活性[28]。這為南酸棗皮果酒良好的保健功能和開(kāi)發(fā)前景提供了數(shù)據(jù)支撐。

2.2 南酸棗皮果酒抑制α-葡萄糖苷酶活性結(jié)果

南酸棗皮果酒可通過(guò)抑制α-葡萄糖苷酶活性，使淀粉水解速度減緩，達(dá)到降血糖的功效，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 負(fù)離子模式下的南酸棗皮果酒總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram in negative ion mode of Choerospondias axillaris fruit peel wine

表1 南酸棗皮果酒色譜峰質(zhì)譜指認(rèn)Table 1 Identification of chemical components of Choerospondias axillaris fruit peel wine

表2 南酸棗皮果酒中總黃酮、總原花青素和總酚的含量測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination results of total flavonoids，total proanthocyanidins and total phenols in Choerospondias axillaris fruit peel wine mg/mL

圖2 南酸棗皮果酒抑制α-葡萄糖苷酶活性結(jié)果Fig.2 The inhibition activity on α-glucosidase of Choerospondias axillaris fruit peel wine

如圖2所示，α-葡萄糖苷酶抑制率隨樣品和阿卡波糖濃度增加而升高，當(dāng)南酸棗皮果酒的濃度達(dá)到50 mg/mL時(shí)，對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率可達(dá)到75%。用SPSS 21.0軟件計(jì)算IC50值，南酸棗皮果酒抑制α-葡萄糖苷酶活性的IC50值為10.996 mg/mL，阿卡波糖為0.0915 mg/mL。南酸棗皮果酒的α-葡萄糖苷酶抑制活性與其含有豐富的總黃酮、總原花青素和總酚等化學(xué)成分有關(guān)。

2.3 南酸棗皮果酒的體外抗氧化活性

南酸棗皮果酒體外抗氧化活性結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 南酸棗皮果酒體外抗氧化活性結(jié)果Fig.3 The antioxidant activity in vitro of Choerospondias axillaris fruit peel wine

由圖3可知，南酸棗皮果酒具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。DPPH自由基清除率隨樣品和維生素C濃度增加而升高，當(dāng)南酸棗皮果酒的濃度達(dá)到40 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率可達(dá)到99.95%。用SPSS 21.0軟件計(jì)算IC50值，南酸棗皮果酒清除DPPH自由基的IC50值為2.656 mg/mL，維生素C為16.35 μg/mL。由于南酸棗皮果酒中富含種類(lèi)更為豐富的黃酮和多酚等抗氧化活性成分，所以南酸棗皮果酒具有一定的DPPH自由基清除能力和體外抗氧化活性。

3 討論與結(jié)論

南酸棗在食品領(lǐng)域開(kāi)發(fā)利用的過(guò)程中，產(chǎn)生了大量棗皮副產(chǎn)物未得到充分利用，不但造成了資源的浪費(fèi)，還帶來(lái)了環(huán)境污染問(wèn)題。在開(kāi)展南酸棗皮副產(chǎn)物化學(xué)成分和生物活性研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了南酸棗皮果酒等高值化產(chǎn)品研發(fā)。南酸棗皮果酒酒精度低，口感好，適用人群廣泛，操作簡(jiǎn)單，生產(chǎn)方便有利于南酸棗皮的綜合利用，提升其附加價(jià)值，拓展南酸棗產(chǎn)業(yè)鏈，為類(lèi)似廢棄物的綜合利用提供思路[30]。

現(xiàn)有文獻(xiàn)研究表明南酸棗果皮含有豐富的原花青素、有機(jī)酸、黃酮和酚類(lèi)化合物[1，18-20]。本試驗(yàn)采用UPLC-Q-TOF-MS/MS聯(lián)用和紫外分析檢測(cè)技術(shù)，對(duì)南酸棗皮果酒進(jìn)行化學(xué)成分定性定量分析，并評(píng)價(jià)南酸棗皮果酒的抗氧化及抑制α-葡萄糖苷酶活性。通過(guò)對(duì)照品比對(duì)和參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，從南酸棗皮果酒中發(fā)現(xiàn)34個(gè)化合物，南酸棗皮果酒的化學(xué)組成比南酸棗果皮更為豐富，南酸棗皮果酒在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了種類(lèi)更為豐富的酯類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)和黃酮類(lèi)化合物。南酸棗皮果酒中新產(chǎn)生的酯類(lèi)成分如阿魏酸酒石酸酯、原兒茶酸己糖酯，可以使南酸棗皮果酒呈現(xiàn)發(fā)酵的濃郁果香。果酒發(fā)酵過(guò)程中新產(chǎn)生的有機(jī)酸類(lèi)成分如丁香酸、花生酸、花生油酸和對(duì)香豆?？崴?，不但可以使南酸棗皮果酒呈現(xiàn)獨(dú)特的風(fēng)味，還能起到改善食欲，促進(jìn)消化吸收，調(diào)節(jié)人體酸堿平衡的作用。南酸棗皮果酒中新產(chǎn)生的黃酮類(lèi)化合物有槲皮素-3-O-阿拉伯糖苷、牡荊素和EPSILON-白藜蘆醇脫氫二聚體。體外活性試驗(yàn)表明，南酸棗皮果酒展現(xiàn)出一定的抗氧化能力和體外降血糖活性。此研究結(jié)果為南酸棗皮果酒等高值化產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和南酸棗果皮廢棄物的綜合利用提供數(shù)據(jù)支撐。