朱芳茜，何擴(kuò)*，張秀媛，魏東，王碩，李育峰，陳一，趙瑞平

（1.河北省農(nóng)產(chǎn)品食品質(zhì)量安全與檢測重點實驗室，河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000；2.南開大學(xué)，天津 300000）

志賀氏菌（Shigella sp.）是人類細(xì)菌性痢疾最為常見的病原菌，在我國感染性腹瀉病原菌中高居首位，它主要侵染人體的結(jié)腸，引發(fā)腸道炎癥、潰瘍以及頻繁的黏液性血性腹渾，少數(shù)嚴(yán)重可導(dǎo)致驚厥、低鈉血癥、低血糖、溶血性尿毒綜合征、腸穿孔和死亡[1-2]。每年全世界有1.6億人傳染此類疾病，約有110萬人死亡，其中5歲以下兒童為主要受害者[3]。在我國，由于水源或食品受到志賀氏菌污染而引起痢疾、腹瀉等疾病時有發(fā)生[4]。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確的志賀氏菌檢測方法顯得尤為重要。

目前，志賀氏菌常規(guī)檢測方法主要有兩大類：一是傳統(tǒng)培養(yǎng)計數(shù)法，二是快速檢測法。傳統(tǒng)生化培養(yǎng)法具有結(jié)果準(zhǔn)確，且無需復(fù)雜設(shè)備等特點，但由于步驟繁瑣、周期長、試劑繁多等缺陷，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代快速檢測的需要[5-6]。基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)、分子生物學(xué)原理的各種快速檢測法具有檢測準(zhǔn)確的優(yōu)點，但由于其需要昂貴的試劑和設(shè)備、有時需帶回專業(yè)實驗室檢測等缺陷，無法滿足現(xiàn)場分析的需要[7-9]。熒光量子點（quantum dot，QD）本身具備光穩(wěn)定性好、熒光強(qiáng)度高、激發(fā)光譜寬而連續(xù)、發(fā)射光譜窄而對稱、發(fā)射波長可調(diào)等優(yōu)越的發(fā)光特點，且通過對量子點表面修飾不同的官能團(tuán)（如-COOH、-NH2），即可使其很容易與生物大分子如抗體等進(jìn)行偶聯(lián)[10-11]，因此，以量子點作為標(biāo)記物可顯著提高免疫層析試紙條的靈敏度和穩(wěn)定性。此外，運用發(fā)射波長差異的多種熒光量子點分別偶聯(lián)多種檢測抗體，可實現(xiàn)多種抗原的集成定量檢測[12-13]。

本研究采用CdTe量子點偶聯(lián)志賀氏菌抗體作為熒光標(biāo)記，制備一種用于能快速可視化檢測志賀氏菌的免疫熒光試紙條，原理見圖1，該試紙條可實現(xiàn)對肉品中志賀氏菌的快速、簡便、可視化定量檢測。

圖1 量子點熒光免疫層析試紙條示意圖Fig.1 Schematic diagram of quantum dots fluorescent immunochromatographic strip

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冰醋酸鎘[Cd（CH3COO）2·2H2O]、亞碲酸鉀（K2TeO3）、硼氫化鈉（分析純，96%）、氫氧化鈉（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；谷胱甘肽、羊抗鼠二抗：美國Sigma公司；志賀氏菌鼠單克隆抗體：河北省農(nóng)產(chǎn)品食品質(zhì)量安全檢測重點實驗室（河北北方學(xué)院）自制；志賀氏菌（ATCC12022）、沙門氏菌（ATCC 50071）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538）菌株：河北省農(nóng)產(chǎn)品食品質(zhì)量安全檢測重點實驗室保存制備；樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水紙：上海金標(biāo)生物科技有限公司；志賀氏菌膠體金試紙條：廣州市益滿生物科技有限公司；豬肉、火腿腸：市售；其它試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

JEM-2100高分辨率透射電子顯微鏡：日本電子株式會社；F-2500 FL熒光光譜儀：日本Hitachi公司；pHS-3C酸度計：上海雷磁公司；HM3230點膜儀、ZQ2002自動切條儀：上海金標(biāo)生物科技有限公司；WI95549冷凍干燥儀：東西儀（北京）科技有限公司；GZX-9240MBE電熱恒溫干燥箱：上海博迅實業(yè)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 CdTe量子點的制備

稱取15.6 mg的冰醋酸鎘溶解于50 mL雙蒸水中，然后加入20 μL谷胱甘肽，緩慢滴加1 mol/L的氫氧化鈉溶液，至pH10.5。稱取5 mg的亞碲酸鉀溶解于50 mL雙蒸水中，將pH10.5冰醋酸鎘溶液和亞碲酸鉀溶液混合到一起，稱取40 mg的硼氫化鈉加入混合液中，攪拌至硼氫化鈉完全溶解為止后將溶液轉(zhuǎn)入到250 mL的三口圓底燒瓶，油浴加熱，100℃回流3 h，取樣2 mL于離心管中，分別用透射電子顯微鏡以及熒光光譜儀對其進(jìn)行表征[14-15]。

1.3.2 量子點標(biāo)記志賀氏菌抗體

取150 μL的谷胱甘肽穩(wěn)定的CdTe量子點溶液加入到1 mL pH7.4 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer solution，PBS）中，加入 50 μL 對乙基-N，N-二甲基丙基碳二亞胺 [1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC]和 50 μL N-N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS），振蕩條件下活化20min，加入20 μL志賀氏菌單克隆抗體，37℃、180 r/min振蕩4 h，加入濃度為1%的牛血清白蛋白?；靹?30 min，15 000 r/min 離心 20 min，取沉淀，備用[16]。

1.3.3 熒光免疫層析試紙條組裝

在硝酸纖維膜上用HM3230點膜儀噴涂志賀氏菌鼠抗和羊抗鼠二抗形成檢測帶和質(zhì)控帶，將量子點標(biāo)記好的志賀氏菌抗體均勻地噴涂在樣品墊上，將樣品墊、硝酸纖維膜和吸水墊依次組裝，用試紙條切刀切割成試紙條，干燥箱干燥后封裝，避光保存于4℃?zhèn)溆肹17-18]。

1.3.4 試紙條檢測方法建立及其結(jié)果判定

將志賀氏菌菌懸液10倍梯度稀釋制備的1×102CFU/mL～1×108CFU/mL志賀氏菌菌液分別滴加到試紙條加樣孔中，反應(yīng)5 min，待免疫反應(yīng)達(dá)到平衡后，在紫外燈下觀察質(zhì)控線和檢測線，每個樣本重復(fù)測定6次。結(jié)果判定：目視T帶的熒光強(qiáng)度，與空白對照，熒光越弱，代表待測溶液中含被測物的濃度越低，出現(xiàn)熒光的最低濃度即為最低檢測限。

1.3.5 試紙條在食品樣品中檢測適用性評價

選取火腿腸、豬肉（肉制品實際樣品）作為檢驗對象，稱取1 g火腿腸和豬肉分別加5 mL超純水搗碎，濾去火腿和豬肉腸渣，分別取0.9 mL火腿腸和豬肉過濾液，加入100 μL志賀氏菌菌液。樣品分別10倍梯度稀釋成菌濃度約 1×105、1×104、1×103CFU/mL 待測，待測液分別用制備量子點熒光免疫層析試紙條和市售志賀氏菌膠體金試紙條進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 CdTe量子點的結(jié)構(gòu)表征

量子點的結(jié)構(gòu)表征結(jié)果見圖2。

圖2 CdTe量子點表征Fig.2 Symptom of CdTe quantum dots

從圖2（A）中可以看出，量子點微球的發(fā)射峰對稱且窄，同時量子點的熒光強(qiáng)度可達(dá)到9000左右，從圖2（B）可以看出制備的CdTe量子點大小均勻，粒徑大小約為50 nm。說明合成的量子點較好。

2.2 量子點與志賀氏菌抗體的偶聯(lián)

通過EDC/NHS活化體系活化后，偶連量子點與志賀氏菌抗體，分別取2 mL用PBS稀釋的量子點、量子點與抗體偶聯(lián)物、抗體原液，200 nm～800 nm全波長下紫外掃描鑒定，掃描結(jié)果見圖3。

圖3 量子點-抗體復(fù)合物紫外全波長掃描圖Fig.3 Full-wavelength scanning of quantum dot-antibody complex

量子點與抗體偶聯(lián)后，量子點的吸光度強(qiáng)度變大，志賀氏菌抗體的吸收峰基本接近于量子點的最大激發(fā)波長，導(dǎo)致量子點與抗體偶聯(lián)物的最大激發(fā)波長發(fā)生藍(lán)移。

2.3 量子點熒光免疫層析試紙靈敏度

將志賀氏菌菌懸液10倍梯度稀釋制備的1×102CFU/mL～1×108CFU/mL志賀氏菌菌液分別滴加到試紙條加樣孔中進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果見圖4。

圖4 熒光免疫試紙條靈敏度Fig.4 Sensitivity of fluorescent immunostrip

隨著志賀氏菌濃度的降低，熒光強(qiáng)度越來越弱，當(dāng)志賀氏菌濃度小于1×103CFU/mL，熒光消失，所以熒光免疫試紙條的檢測限為1×103CFU/mL。

2.4 量子點免疫層析試紙?zhí)禺愋栽u價

將沙門氏菌、肉毒梭菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、蠟樣芽桿菌稀釋成濃度為1×107CFU/mL，用制備的熒光免疫層析試紙條進(jìn)行檢測，每種菌樣同一濃度重復(fù)檢測6次，通過有無熒光判斷試紙條的交叉反應(yīng)性，結(jié)果見圖5。

圖5 熒光免疫試紙條特異性Fig.5 Specificity of fluorescent immunostrip

試驗顯示制備的熒光免疫層析試紙條與其它致病菌均無交叉反應(yīng)，表明制備的試紙條特異性較好。

2.5 試紙條在食品樣品中檢測適用性評價

利用CdTe量子點制備的熒光免疫試紙條和酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒對添加的志賀氏菌肉類實際樣品進(jìn)行檢測，每個濃度菌樣檢測6次。檢測結(jié)果見表1。

表1 量子點熒光免疫試紙條適用性測試Table 1 Applicability test of quantum dots fluorescent immunostrip

當(dāng)菌樣添加質(zhì)量濃度為1×103CFU/mL時，試紙條檢測均為陰性；志賀氏菌添加濃度為1×104CFU/mL時，熒光免疫試紙條檢測結(jié)果為陽性，而膠體金試紙條為陰性。添加濃度為1×105CFU/mL時，熒光免疫試紙條和膠體金試紙條檢測結(jié)果均為陽性，表明制備的熒光免疫試紙條對肉類實際樣品的檢測限為1×104CFU/mL，與膠體金試紙條相比，其靈敏度仍要高一個數(shù)量級。

3 結(jié)論

本試驗利用谷胱甘肽為穩(wěn)定劑成功合成了水溶性CdTe量子點，在EDC和NHS共價偶聯(lián)的作用下，通過酰胺鍵連接了志賀氏菌單克隆抗體，在優(yōu)化的試驗條件下，成功制備了一種能特異性檢測志賀氏菌的熒光免疫試紙條，其對肉制品實際樣品的檢測限可達(dá)1×104CFU/mL（目前市場上廣泛引用的膠體金試紙條的檢出限為1×104CFU/mL），為志賀氏菌市場快速檢測提供了一個新的方法。