云瀚漩，蓋雪姣，韓振宇，劉明珠，范龍興，張櫻櫻，白家磊，寧保安，劉穎*

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院環(huán)境醫(yī)學與作業(yè)醫(yī)學研究所，天津 300050；3.福州大學化學學院食品安全與生物分析教育部重點實驗室，福建 福州 350116）

己烯雌酚（diethylstilbestrol，DES）是一種人工合成的非甾體雌激素，常在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中被作為促生長劑使用，易在動物肝臟、脂肪、肌肉、乳汁中沉積[1-2]。DES已被世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)列為一類致癌物，接觸后甚至可對后代產(chǎn)生致癌影響[3]。與DES不同，17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）為天然類固醇雌激素[4]，具有較高活性[5]，已有研究證明牛羊體內(nèi)的雌激素可釋放至乳汁中[6]，攝入過量會影響代謝和發(fā)育，增大腫瘤的發(fā)生風險[7-9]，引起一系列健康問題。

目前，常用于檢測食品中雌激素的方法包括色譜法[10-11]、電化學分析法[12-13]、免疫分析法[14-15]等。色譜法具有較高靈敏度，但儀器體積較大，對操作要求高，針對復(fù)雜樣品的前處理工作繁雜，不適合現(xiàn)場快速檢測。電化學分析法在保證靈敏度的前提下操作簡單，但對目標物的電活性有一定要求[16]，穩(wěn)定性和特異性均欠佳。傳統(tǒng)免疫分析法檢測時間較長，需接觸危險試劑，對操作人員健康存在隱患。因此，研究一種快速便攜、靈敏度高、特異性好、健康安全的方法用于牛奶中雌激素現(xiàn)場檢測具有重要意義。

量子點（quantum dots，QDs）具有光學性質(zhì)穩(wěn)定、激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、粒徑和發(fā)射光譜可調(diào)節(jié)等優(yōu)點。通過在QDs核殼表面修飾不同基團，可實現(xiàn)其與生物大分子的偶聯(lián)[17]，進而用于定量檢測不同目標物[18-19]。

本文以傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）的原理為依托，用QDs代替辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠二抗，建立了牛奶中DES的熒光免疫檢測法，同時用該原理建立了牛奶中E2的檢測方法，優(yōu)化檢測條件后，均得出較低檢測限。與傳統(tǒng)ELISA相比，該方法所需時間更短，操作更加安全，可作為傳統(tǒng)方法的補充用于實際樣品現(xiàn)場快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

96孔黑色底透酶標板：ThermoFisher公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）：Sigma公司；CdSe/ZnS雜化QDs標記的羊抗小鼠二抗（QDs-antibody2，QDs-Ab2，1mg/mL，激發(fā)波長307nm，發(fā)射波長 625nm）：上海昆道生物技術(shù)有限公司；DES完全抗原（4.0mg/mL）、抗DES單克隆抗體（7.7mg/mL）、E2完全抗原（9.7mg/mL）、抗E2單克隆抗體（6 mg/mL）：山東綠都生物科技有限公司；DES標準品及其類似物（100 μg/mL）、E2標準品及其類似物（100 μg/mL）：北京百靈威科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SpectraMax M5多功能酶標儀：Molecular Devices公司；F97Pro熒光分光光度計：上海棱光技術(shù)有限公司；DRP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱：中國森信公司；6410B液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抗原抗體濃度優(yōu)化

將抗原抗體按照梯度稀釋后做方陣滴定試驗，稀釋體積比例依次為1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8 000、1 ∶16 000、1 ∶32 000、1 ∶64 000、1 ∶128 000。從結(jié)果中選取熒光響應(yīng)值較高且梯度良好的抗原抗體濃度做間接競爭熒光免疫檢測，將靈敏度較高、熒光響應(yīng)較好的濃度作為抗原包被濃度和一抗?jié)舛扔糜跇藴是€建立。靈敏度參考競爭抑制率，競爭抑制率/%=F/F0×100，F(xiàn)為添加目標物的陽性組熒光值，F(xiàn)0為未添加目標物的陰性組熒光值[20]。

1.3.2 二抗?jié)舛葍?yōu)化

將量子點標記二抗分別稀釋50倍、100倍、150倍、200倍用于試驗，參考結(jié)合信噪比優(yōu)化濃度[21]。

1.3.3 緩沖液濃度優(yōu)化

分別配制5%、10%、15%、20%甲醇磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS），用于小分子標準品的配制，分別做間接競爭試驗，結(jié)合熒光響應(yīng)和靈敏度選擇最適濃度。

1.3.4 緩沖液pH值優(yōu)化

分別配制 pH 值為 6.4、6.8、7.2、7.6、8.0 的甲醇PBS緩沖液，溶解小分子后做競爭試驗，優(yōu)化檢測最適酸堿度。

1.3.5 封閉液優(yōu)化

配制1%、2%、3%的BSA溶液作為封閉液，分別用于競爭試驗進行濃度優(yōu)化。

1.3.6 標準曲線建立

將優(yōu)化后的抗原濃度作為包被濃度，用碳酸鹽緩沖溶液（carbonate buffer solution，CBS）稀釋后加入96孔板，100 μL/孔，4℃過夜。用磷酸鹽緩沖液+0.1%吐溫 20清洗 3次后加入封閉液（1%BSA），160 μL/孔，37℃封閉1 h后再次洗滌。將小分子標準品和抗雌激素抗體（抗體稀釋液稀釋）依次加入96孔板中，各50 μL/孔，37 ℃孵育 1 h。洗液洗滌后加入 QDs-Ab2，100 μL/孔，37℃孵育1 h，洗液清洗后用多功能酶標儀檢測。

1.3.7 特異性試驗

配制雌激素類似物雌三醇（striol，E3）、雙酚 A（bsphenol A，BPA）、己烷雌酚（hexoestrolum）小分子標準液，用于競爭試驗，評價檢測方法對目標物的特異性。

1.3.8 加標回收試驗與方法學比較

于牛奶樣品中加入不同濃度小分子標準液，濃度依次為 DES 1、10、100 ng/mL，E2 0.5、5、50 ng/mL，渦旋混勻后4 000 r/min離心10 min，重復(fù)兩次，取上清液作為樣品進行檢測，評價回收率。

為了驗證研究所建立方法結(jié)果的可靠性與性能優(yōu)勢，將結(jié)果與液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）檢測結(jié)果進行比較，評價方法性能。

物流傳輸一體化：通過區(qū)內(nèi)與各個化學反應(yīng)裝置連成一體的專用輸送管網(wǎng)以及倉庫、碼頭、鐵路和道路等一體化的物流運輸系統(tǒng)，將區(qū)域內(nèi)的原料、能源和中間體安全、快捷地送達目的地。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用OriginPro 2018處理數(shù)據(jù)，對數(shù)據(jù)進行擬合并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原抗體濃度優(yōu)化

包被抗原和抗體濃度是影響檢測方法靈敏度和檢測限的關(guān)鍵，參考競爭抑制率與熒光強度對二者進行優(yōu)化。DES包被抗原及抗體濃度優(yōu)化結(jié)果見圖1，E2包被抗原及抗體濃度優(yōu)化結(jié)果見圖2。

圖1 DES的熒光免疫檢測包被抗原與抗體濃度優(yōu)化結(jié)果Fig.1 Optimal concentration of antigen and monoclonal antibody for DES fluorescent immunoassay

如圖1所示，以1∶1 000的比例稀釋DES抗原包被96孔板，1∶2 000的比例稀釋DES抗體捕獲抗原時，兩者濃度配比最佳，方法較為靈敏。

如圖2所示，當包被所用E2抗原濃度為1∶4 000倍稀釋，捕獲抗原的E2抗體為1∶8 000倍稀釋時檢測靈敏度最高。

2.2 二抗?jié)舛葍?yōu)化

將粒徑為100 nm的CdSe/ZnS雜化QDs修飾羊抗小鼠二抗用于檢測方法建立，其光譜圖見圖3。

如圖3所示，修飾二抗的量子點在307 nm處被穩(wěn)定激發(fā)，625 nm處可接收信號。在將要建立的熒光免疫檢測方法中，QDs-Ab2起到至關(guān)重要的作用，其濃度直接決定輸出的熒光值大小，需對QDs-Ab2的濃度進行優(yōu)化。QDs-Ab2濃度優(yōu)化結(jié)果見表1。

圖2 E2的熒光免疫檢測包被抗原與抗體濃度優(yōu)化結(jié)果Fig.2 Optimal concentration of antigen and monoclonal antibody for E2 fluorescent immunoassay

圖3 QDs二抗的熒光光譜圖Fig.3 The fluorescence spectra of QDs-Ab2

表1 不同濃度二抗的雌激素熒光檢測結(jié)果Table 1 The fluorescence detection of estrogen with different concentrations of QDs-Ab2

結(jié)果表明，在對DES的熒光免疫檢測中，二抗?jié)舛葹?0 μg/mL時所得信噪比最高，熒光響應(yīng)值也較高。同時對E2檢測的二抗?jié)舛冗M行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)20μg/mL時的檢測信噪比最高，結(jié)合經(jīng)濟角度考慮，最終選擇10 μg/mL作為E2檢測的二抗最適濃度。

2.3 緩沖液濃度優(yōu)化

圖4 DES的熒光免疫檢測緩沖液優(yōu)化結(jié)果Fig.4 Optimal concentration of buffer for DES fluorescent immunoassay

圖5 E2的熒光免疫檢測緩沖液優(yōu)化結(jié)果Fig.5 Optimal concentration of buffer for E2 fluorescent immunoassay

如圖4所示，當緩沖液中甲醇比例為15%時，DES檢測的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）最低，而最大熒光值與IC50的比值最大，表明在該緩沖液濃度下，檢測得到了更高的靈敏度和相對熒光值。

如圖5所示，在對E2做相同優(yōu)化后，得出的最適比例為20%。

2.4 緩沖液pH值優(yōu)化

在對緩沖液中甲醇濃度進行探究后，進一步優(yōu)化緩沖液pH值。在DES檢測中，一定范圍內(nèi)，酸堿度對靈敏度的影響較小，優(yōu)化的最適pH 7.2，優(yōu)化結(jié)果見圖6，E2檢測中，緩沖液pH 6.8時得到了較高靈敏度，優(yōu)化結(jié)果見圖7。

圖6 DES的熒光免疫檢測pH值優(yōu)化結(jié)果Fig.6 Optimal pH for DES fluorescence immunoassay

圖7 E2的熒光免疫檢測pH值優(yōu)化結(jié)果Fig.7 Optimal pH for E2 fluorescence immunoassay

2.5 封閉液優(yōu)化

為了驗證封閉液濃度是否會對檢測靈敏度產(chǎn)生影響，分別采用1%、2%、3%的BSA對試驗進行優(yōu)化，DES與E2檢測封閉液優(yōu)化結(jié)果分別如圖8、圖9所示，兩種目標物檢測方法最適封閉液濃度均為1%。

圖8 DES的熒光免疫檢測封閉液優(yōu)化結(jié)果Fig.8 Optimal sealing fluid concentration for DES fluorescence immunoassay

2.6 標準曲線建立

結(jié)合優(yōu)化結(jié)果中的最適檢測條件，建立DES熒光免疫檢測標準曲線。結(jié)果見圖10。

圖9 E2的熒光免疫檢測封閉液優(yōu)化結(jié)果Fig.9 Optimal sealing fluid concentration for E2 fluorescence immunoassay

圖10 DES的熒光免疫檢測標準曲線Fig.10 Standard curve of DES fluorescence immunoassay

如圖10所示，目標物濃度在0.418 ng/mL～195.065 ng/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性方程為y=18.995-6.434x，線性擬合優(yōu)度R2=0.997，最低檢測限為0.109 ng/mL，IC50為 8.515 ng/mL。

建立E2熒光免疫檢測標準曲線。結(jié)果見圖11。

如圖11所示，目標物濃度在0.472 ng/mL～66.597ng/mL內(nèi)呈線性關(guān)系，線性方程為y=7.858-3.197x，線性擬合優(yōu)度R2=0.987，最低檢測限為0.236 ng/mL，IC50為 2.865 ng/mL。

2.7 特異性試驗

兩種雌激素熒光免疫檢測特異性試驗結(jié)果見表2。

表2 兩種雌激素熒光免疫檢測特異性試驗結(jié)果Table 2 The specificity of fluorescence immunoassay for two kinds of estrogen

在特異性試驗中，分別證明了檢測方法對兩種雌激素具有良好選擇性，對類似物交叉反應(yīng)率較低，可用于復(fù)雜樣品的檢測。

2.8 加標回收試驗與方法學比較

兩種雌激素熒光免疫檢測回收率試驗結(jié)果見表3。

表3 兩種雌激素熒光免疫檢測回收率試驗結(jié)果（n=3）Table 3 Recovery of two kinds of estrogens with fluorescence immunoassay

根據(jù)加標回收試驗結(jié)果分析，所建立方法回收率良好，結(jié)果穩(wěn)定，表明該方法可用于牛奶實際樣品中DES、E2的檢測。

為評價研究所建立方法與其它方法相比結(jié)果是否一致、性能是否存在優(yōu)勢，選擇液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)法與本研究所建立方法就檢測限和加標檢測結(jié)果進行比較。結(jié)果如表4所示。

本研究所建立方法與液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)法結(jié)果一致，加標樣品均顯示陽性，可用于實際樣品檢測。相比之下，熒光免疫檢測法對于樣品前處理方法要求靈活，無需繁雜程序，在節(jié)省時間的基礎(chǔ)上可降低處理過程對樣品中目標物的損耗。更值得關(guān)注的是，免疫熒光檢測不依賴大型儀器，不僅節(jié)約檢測成本，還為實現(xiàn)現(xiàn)場檢測提供了可能。而與傳統(tǒng)ELISA相比，熒光免疫檢測法無需顯色即可直接檢測，不僅縮短了檢測時間，還可免去在過程中使用強酸作為終止液，方法更加綠色安全，具有較高推廣價值。

表4 熒光免疫檢測法與LC-MS/MS方法學比較結(jié)果（n=3）Table 4 Fluorescence immunoassay was compared with LC-MS/MS methodology（n=3）

3 結(jié)論

分別建立了檢測牛奶中DES、E2殘留的熒光免疫檢測法，得到了較好的回收率和較低交叉反應(yīng)率，可對實際樣品進行檢測。所建立方法不依靠大型儀器設(shè)備和專業(yè)操作，與傳統(tǒng)免疫方法相比檢測時間更短，操作過程綠色安全。具有前處理簡單、安全、快速、靈敏、特異等優(yōu)點，可補充傳統(tǒng)方法，用于牛奶中雌激素獸藥殘留的快速檢測。同時，方法可用于其它小分子污染物在食品中的快速檢測，發(fā)展前景良好。