許晨霞 余學(xué)高 黃浩 林少賓 陳培松*

（1.中山市博愛醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，廣東中山 528400；2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 510080；3.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院胎兒醫(yī)學(xué)中心，廣東廣州 510080）

無創(chuàng)產(chǎn)前檢測目前已廣泛用于13、18、21-三體篩查，靈敏度及特異度均達(dá)到99%［1，2］。胎兒的游離DNA（cell-free DNA，cf DNA）已被證實(shí)僅起源于低甲基化的胎盤組織，而母體cf DNA來源于甲基化的造血和肝組織［3，4］。在母體血液中自由循環(huán)的DNA，絕大部分來自于母體本身，胎兒游離DNA（cell-free fetal DNA，cff DNA）的平均濃度為10%～15%，變化范圍可達(dá)3%～30%［5］。cff DNA篩查要求胎兒游離DNA濃度不能過低，即母體血液中來源于胎兒的cf DNA的比例不能過低，小于3%或4%的樣本是不合格的［6］。無創(chuàng)產(chǎn)前檢測（noninvasive prenatal testing，NIPT）技術(shù)逐步由第三方檢測機(jī)構(gòu)轉(zhuǎn)化到醫(yī)院平臺，運(yùn)用醫(yī)院平臺為孕產(chǎn)婦做檢測更重要的是能夠根據(jù)妊娠結(jié)局的隨訪情況與臨床醫(yī)生溝通，使醫(yī)生能更科學(xué)合理的為孕產(chǎn)婦做產(chǎn)前咨詢。然而，不論是使用何種平臺檢測，都不可避免出現(xiàn)臨界風(fēng)險(xiǎn)灰區(qū)（gray-area）病例。迄今為止，這些病例的妊娠結(jié)局并沒有引起大家太多的關(guān)注。本研究的目的在于回顧性分析灰區(qū)病例的妊娠結(jié)局，初步探討灰區(qū)結(jié)果可能的原因以及臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2017年3月至2020年7月，在中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院分子診斷中心做NIPT檢測的孕婦，檢測結(jié)果在臨界風(fēng)險(xiǎn)值范圍T13（3.0＜Z＜4.39）；T18（3.0＜Z＜4.64）；T21（3.0＜Z＜5.08）的病例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法 采集孕婦靜脈血5ml，采血用EDTA-K2管4℃保存8h。3500rpm 4℃離心10min分離血漿，分離后的血漿于16 100g 4℃離心10min。采用磁珠法（中山大學(xué)達(dá)安基因生產(chǎn)的核酸提取試劑盒）提取孕婦血漿中的cf DNA。文庫質(zhì)檢試劑及試劑盒（上海立菲生物技術(shù)有限公司：高靈敏度熒光染料DNA檢測試劑盒；安捷倫科技有限公司：高敏感度DNA芯片）。文庫構(gòu)建步驟包括末端修復(fù)、DNA片段加接頭、PCR擴(kuò)增DNA片段。文庫定量、上機(jī)測序、質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)等流程后數(shù)據(jù)分析得到Z值。采用DA8600 proton平臺（the ion proton semiconductor sequencing platform）進(jìn)行半導(dǎo)體測序法檢測。

結(jié)果判讀：檢測結(jié)果Z值T13（Z＞4.39）、T18（Z＞4.64）、T21（Z＞5.08）明確判斷為高風(fēng)險(xiǎn)；T13（3.0＜Z＜4.39）；T18（3.0＜Z＜4.64）；T21（3.0＜Z＜5.08）樣本為灰區(qū)樣本，需要進(jìn)行重復(fù)檢測；Z≤3為低風(fēng)險(xiǎn)。第2次重新建庫后檢測結(jié)果仍然落在灰區(qū)的樣本建議孕婦進(jìn)行侵入性產(chǎn)前檢查明確診斷；Z＜3為低風(fēng)險(xiǎn)，超聲定期監(jiān)測，進(jìn)入常規(guī)孕檢流程。

1.3 介入性產(chǎn)前診斷 為上述NIPT重復(fù)檢測Z值2次均落在灰區(qū)的孕婦提供遺傳咨詢，經(jīng)知情同意后進(jìn)行羊水或者臍血穿刺G顯帶染色體核型分析，以及染色體微陣列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）。

1.4 妊娠結(jié)局的隨訪 對NIPT檢測Z值落在灰區(qū)的病例進(jìn)行產(chǎn)后隨訪和生產(chǎn)時(shí)的詳細(xì)病歷記錄查詢，了解孕產(chǎn)婦本身的身體狀況和新生兒出生時(shí)的健康情況。

2 結(jié)果

2.1 74 例灰區(qū)病例重復(fù)檢測 2017年3月至2020年7月總共4883例孕婦中第1次檢測，74例樣本因所得Z值落在灰區(qū)而需要進(jìn)一步驗(yàn)證，其中包括10例13-三體、12例18-三體、52例21-三體的灰區(qū)病例（圖1）。將上述樣本重新建庫加大測序深度重新檢測74例灰區(qū)病例中有7例Z值仍然在灰區(qū)范圍。我們建議2次Z值灰區(qū)的孕婦行侵入性 產(chǎn)前檢測。

圖1 2次檢測的結(jié)果

2.2 2 次檢測Z值均落在灰區(qū)病例的分析 加大測序深度后檢測Z值落在灰區(qū)的7例病例中，18-三體灰區(qū)2例（其中有1例失訪），21-三體灰區(qū)5例。以上孕婦經(jīng)知情同意后進(jìn)行羊水或者臍血穿刺行G顯帶染色體核型和染色體微陣列分析。結(jié)果1例21-三體，1例21-三體24%的嵌合體，1例新生兒心臟畸形，其余病例染色體核型和染色體微陣列分析未見異常（表1）。

表1 第二次檢測21、18三體灰區(qū)病例新生兒情況及Z值

2.3Z值灰區(qū)的74例病例進(jìn)行孕婦自身情況和結(jié)果分析 產(chǎn)婦平均年齡為34.5歲，其中大于35歲的有38例（51%，38／74）。12～13＋6周36例，14～27＋6周36例，2例孕周大于28周。表2中可知，增大測序深度后，13、18、21-三體的Z值平均值較第一次檢測結(jié)果相比明顯下降，而cff DNA的平均濃度并沒有隨著唯一匹配讀數(shù)（unique reads，UR）增加而增加。

表2 74例灰區(qū)病例2次檢測結(jié)果的對比

2.4 灰區(qū)病例再次檢測Z＜3病例的妊娠結(jié)局分析 第一次檢測Z值落在灰區(qū)，而加大測序深度再次檢測Z＜3的陰性病例67例，44例有產(chǎn)后隨訪結(jié)果，2例失訪。這44例灰區(qū)病例中高危兒11例，所占比例高達(dá)25%；早產(chǎn)兒8例，所占比例20.4%。

表3 臨界風(fēng)險(xiǎn)區(qū)新生兒情況

3 討論

灰區(qū)是NIPT檢測中常見的情況，對于灰區(qū)標(biāo)本的臨床處理流程目前尚無指南，且臨床意義未知。2017年3月至2020年7月期間，在中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院行NIPT檢測的4883孕婦中發(fā)現(xiàn)74例灰區(qū)病例，占總數(shù)據(jù)的1.5%。加大測序深度復(fù)查后，有67例（90.5%，67／74）檢測結(jié)果為低風(fēng)險(xiǎn)免于侵入性產(chǎn)前檢測。由于NIPT檢測的準(zhǔn)確度和測序深度存在較大的關(guān)聯(lián)，因此我們以第二次檢測的結(jié)果為準(zhǔn)。重復(fù)檢測雖然能降低13、18、21-三體的假陽性率，但當(dāng)出現(xiàn)Z值落在灰區(qū)時(shí)臨床醫(yī)生應(yīng)該詳細(xì)追蹤隨訪其妊娠結(jié)局。對于灰區(qū)復(fù)查陽性的7例病例中，1例21-三體、1例21-三體24%的嵌合體，說明對于灰區(qū)重復(fù)檢測能夠避免漏掉一些真陽性病例。在NIPT檢測中，國內(nèi)外有很多研究把更多注意力放在實(shí)驗(yàn)的檢出率、陽性預(yù)測值、漏檢率等方面，而往往忽視了灰區(qū)病例的妊娠結(jié)局。許多生物學(xué)因素可導(dǎo)致NIPT檢測結(jié)果與G顯帶染色體核型分析結(jié)果不一致，有時(shí)是胎兒因素，也可能由于母體本身的原因。關(guān)于胎兒的因素包括胎兒部分重復(fù)或缺失、限制性胎盤嵌合和雙胎消失綜合征等［7-9］。研究表明孕期的腫瘤DNA片段直接進(jìn)入血液循環(huán)，從而影響NIPT的檢測結(jié)果［10-12］。常見的良性腫瘤如子宮肌瘤也會(huì)將DNA釋放到血液中［13，14］，這些腫瘤游離DNA使得與參照DNA之間的預(yù)期比例偏移。維生素B12或葉酸缺乏、器官移植、自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡也可能導(dǎo)致血漿中DNA的變化［15，16］。母體本身的染色體結(jié)構(gòu)異也會(huì)導(dǎo)致NIPT結(jié)果異常。當(dāng)檢測值落在灰區(qū)時(shí)，我們應(yīng)該進(jìn)一步研究導(dǎo)致的Z值上升的具體原因。研究報(bào)道2010年全球的早產(chǎn)發(fā)生率為11.1%，2014年為10.6%［17］。我國不同地區(qū)早產(chǎn)發(fā)生率在4.49%～9.90%，最新的研究表明，中國活產(chǎn)早產(chǎn)率為6.70%［18］。對于妊娠結(jié)局的隨訪，我們發(fā)現(xiàn)44例灰區(qū)病例中高危兒11例，所占比例高達(dá)25%；早產(chǎn)兒8例，所占比例20.4%，這遠(yuǎn)超出普通人群的早產(chǎn)發(fā)生率。44例隨訪記錄中25例產(chǎn)婦在生產(chǎn)時(shí)胎兒狀況不良，甚至有3例孕婦發(fā)生自然流產(chǎn)。因此對于灰區(qū)病例特別是NIPT檢測Z值兩次都落在灰區(qū)，而G顯帶染色體核型分析正常的情況下，我不能單純地解釋為假陽性，這其中還涉及了一個(gè)不良的妊娠結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)。在表2中重新建庫加大測序深度雖然UR增加，但是胎兒游離DNA濃度并沒有隨之增加，因此對于胎兒游離DNA濃度低于4%的孕婦建議4周后重新采血檢測或者直接選擇侵入性產(chǎn)前診斷盡快明確診斷。我們的研究發(fā)現(xiàn)灰區(qū)隨訪病例中有8例（18.1%，8／44）為IVF-ET術(shù)后雙胎的病例，IVF-ET的雙胎病例比自然受孕的雙胎病例可能更容易使NIPT檢測的Z值升高。染色體異常是導(dǎo)致不孕癥的重要原因。近年來，有學(xué)者提出染色體多態(tài)性也是導(dǎo)致不孕癥的重要因素［19］，因此選擇輔助生殖技術(shù)的患者中最常見的就是夫妻雙方或者一方有染色體異常情況。這種IVF-ET術(shù)后的病例是由于親本的原因或者由于胎兒本身引起的Z值上升，我們還需要進(jìn)一步的研究?；覅^(qū)結(jié)果和不良妊娠結(jié)局之間是否有因果關(guān)系還要進(jìn)一步的臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)和更大的數(shù)據(jù)量進(jìn)行研究。

我們的結(jié)果提示，當(dāng)NIPT檢測Z值在灰區(qū)時(shí)，應(yīng)該引起實(shí)驗(yàn)室人員和臨床醫(yī)生的重視，一方面可能存在假陽性的問題，而另一方面孕婦不良妊娠結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)明顯提高。