李佳茹，曹韻茗，楊郁鵬，司佳弘，趙季宇，任華山，金曉飛△，燕 平

(1.山西中醫(yī)藥大學，山西 晉中 030619；2.鄭州澎青醫(yī)學高等?？茖W校，河南 鄭州 450064)

膝關節(jié)骨性關節(jié)炎(Knee osteoarthritis，KOA)是一種常見的慢性持續(xù)性疾病，臨床上根據發(fā)病原因分為原發(fā)性骨關節(jié)病和繼發(fā)性骨關節(jié)病[1]，原發(fā)性膝骨關節(jié)炎的病因目前沒有明確的探究與說明，發(fā)病人群多以老年人常見，繼發(fā)性骨關節(jié)炎多是在已有的基礎上產生新的病理變化所致，由于各種炎癥的增生，膝關節(jié)內部穩(wěn)定結構被破壞，出現(xiàn)關節(jié)疼痛腫脹等相關癥狀[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，膝骨關節(jié)炎的發(fā)生與膝關節(jié)周圍韌帶損傷有關，膝關節(jié)韌帶由致密的結締組織構成，不僅可以控制關節(jié)滑動，維持關節(jié)穩(wěn)定，還可以保持關節(jié)面的生理壓力，減少摩擦，起到保護關節(jié)軟骨作用[3]。本研究基于TGF-β1/Smads信號通路，以針刀刺激與電針“內膝眼”“外膝眼”等作為對照，觀察KOA兔韌帶組織中TGF-β1、Smad4、基質金屬蛋白酶-9(Matrix metalloprotein-9，MMP-9)mRNA及蛋白表達的影響，闡述針刀干預對KOA兔的作用機制及對韌帶組織形態(tài)結構的影響，進一步探討其作用與TGF-β1/Smads信號通路的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

日本大耳白兔32只，SPF級，雌雄各半，體質量(2.25±0.1)kg。由北京市昌揚西山養(yǎng)殖場提供[許可證號：SCXK-(京)2016-0007]，適應性喂養(yǎng)7 d后隨機分為空白組、模型組、電針組和針刀組，每組8只。除空白組外，其余3組均造模。本研究經山西中醫(yī)藥大學動物實驗倫理審查批準。

1.2 主要試劑及儀器

BCA蛋白定量試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；一次性無菌針刀、針灸針(北京中研太和醫(yī)療器械有限公司)；Smad4一抗(愛博泰克生物科技有限公司)；TGF-β1一抗(武漢博士德生物工程有限公司)；MMP-9一抗(武漢博士德生物工程有限公司)；顯微鏡(日本尼康株式會社)；凝膠成像分析儀(U-niversal HoodⅡ Bio-rad)；Tanon5200全自動化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)(上海天能生物科技有限公司)；移液器(美國Thermo公司)；熒光定量PCR儀(杭州博日科技有限公司)等。

1.3 KOA兔造模及干預措施

根據文獻[4]，采用改良的Videman法即左后肢伸直位固定制動法造模，除空白組外，其余3組實驗兔左下肢用石膏繃帶固定6周，結束后取各組膝關節(jié)軟骨組織作病理觀察，顯示造模成功后進行治療。1周后，空白組和模型組不做干預；電針組取穴參照《實驗針灸學》兔腧穴定位[5]選取陰陵泉、陽陵泉、內膝眼和外膝眼，選用0.18 mm×25 mm毫針直刺0.3 cm，以華佗牌電子針治療儀，分別連接陰陵泉和陽陵泉，內膝眼和外膝眼。波形疏密波，頻率2/100 Hz，強度3 mA，每次20 min，以局部肌肉開始輕度抖動、KOA兔不掙扎為度，隔日治療1次，1周治療3次，共治療3周；針刀組在兔膝關節(jié)針刀進針部位，選用一次性無菌針刀，規(guī)格0.35 mm×30 mm，以龍膽紫定位，常規(guī)備皮、消毒，然后刺入針刀，出針并按壓片刻止血，每周1次，共3次，進針點操作：針刀于內、外韌帶中點前緣進針，刀口線與韌帶平行，刀體與皮膚切面垂直刺入，向韌帶起止點方向分別松解，出刀并加壓片刻。

1.4 指標檢測

1.4.1 組織形態(tài)觀察 各組兔用10%的水合氯醛按3 mL/kg腹腔注射麻醉，取左側膝關節(jié)外側中斷韌帶組織，切成0.5 cm×0.3 cm×0.1 cm小塊，立即放置于4%多聚甲醛中固定48 h，EDTA 脫鈣完全后修切并進行常規(guī)石蠟包埋，5 μm厚度連續(xù)切片，HE染色后光鏡下觀察。

1.4.2 關節(jié)腔內狀態(tài)觀察 打開兔膝關節(jié)腔，肉眼大體觀察各組兔膝關節(jié)的滑膜、周圍韌帶、肌肉-肌腱和關節(jié)囊等大體形態(tài)表現(xiàn)。由兩位觀察者參照JessicaBadendick評分系統(tǒng)[6]對各組兔大體形態(tài)進行評分，要求兩名評分人員同時對樣本進行評估并各自打分，結果取兩者平均值，兩次評估人員相同。見表1。

表1 JessicaBadendick大體形態(tài)評分標準

1.4.3 實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)檢測關節(jié)韌帶組織mRNA含量 分別提取各組兔膝關節(jié)韌帶組織RNA，反轉錄成cDNA單鏈為模板，采用25 μLPCR反應體系：各基因對應上下游引物各2.0 μL，qPCR Mix 12.5 μL，cDNA模板2.0 μL,滅菌雙蒸水8.5 μL。PCR 反應程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s，35個循環(huán)；65 ℃ 5 min；95 ℃ 50 s，預變性95 ℃ 1 min，循環(huán)(40次)，95 ℃ 15 s→58 ℃ 20 s→72 ℃ 20 s末段延伸，72 ℃ 5 min，溶解曲線，72 ℃→95 ℃，每20 s升溫1 ℃選取GAPDH為內參基因。采用2-△△CT表示各基因的相對表達量。見表2。

表2 引物序列

1.4.4 免疫印跡法(Western Blot，WB)法檢測關節(jié)韌帶組織蛋白含量 將凍存于-80 ℃冰箱的韌帶組織取出備用，使用RIPA裂解液將細胞裂解，按說明書步驟配制總蛋白溶液，置于組織勻漿器中，12 000 rpm離心5 min，取上清，使用BCA試劑盒測定蛋白質濃度。取總蛋白上樣，電泳，切膠，轉至PVDF膜上，使用5%的脫脂牛奶封閉1 h，加入TGF-β1一抗(1∶1 000)、Smad4一抗(1∶1 000)、MMP-9一抗(1∶1 000)和GAPDH一抗(1∶2 000)，4 ℃搖床過夜，PBST洗膜，加二抗(1∶5 000)，4 ℃搖床過夜，PBST洗膜，ECL發(fā)光試劑盒顯色、顯影，以GAPDH為內參蛋白，用Image J軟件分析各條帶的灰度值，采用目標蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值來表示目的蛋白相對表達水平。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 韌帶組織形態(tài)學觀察

HE染色結果顯示：空白組膝關節(jié)韌帶組織結構完整，韌帶細胞數(shù)目多，排列整齊；模型組韌帶組織結構層次不清，韌帶層薄而粗糙，韌帶細胞數(shù)目少，排列散亂；電針組與模型組比較，韌帶組織結構層次清楚，韌帶細胞增多，但局部細胞排列散亂；針刀組與模型組比較韌帶組織結構完整，韌帶細胞較多，排列整齊，但不及空白組。見圖1。

圖1 各組兔膝關節(jié)韌帶HE染色情況(200×)

2.2 關節(jié)腔內狀態(tài)觀察

JessicaBadendick評分結果顯示：與空白組比較，模型組關節(jié)腔軟骨形態(tài)評分顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組比較，電針組、針刀組關節(jié)腔軟骨形態(tài)評分降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與電針組比較，針刀組評分較低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組JessicaBadendick評分比較

2.3 各組KOA兔韌帶TGF-β1、Smad4及MMP-9 mRNA 表達的影響

與空白組比較，模型組兔韌帶組織中TGF-β1、Smad4 mRNA表達顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，MMP-9 mRNA表達顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組比較，電針組、針刀組TGF-β1、Smad4 mRNA表達較模型組升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，MMP-9 mRNA表達降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；針刀組與電針組比較，TGF-β1 mRNA表達較高，MMP-9表達較低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，Smad4表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，各引物擴增曲線均正常，溶解曲線均單峰，見表4、圖2。

圖2 引物驗證

表4 各組兔韌帶TGF-β1、Smad4和MMP-9 mRNA比較

2.4 各組KOA兔韌帶TGF-β1、Smad4及MMP-9蛋白表達的比較

與空白組比較，模型組兔韌帶組織中 TGF-β1、Smad4蛋白表達顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，MMP-9蛋白表達顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組比較，電針組、針刀組TGF-β1、Smad4蛋白表達較模型組均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，MMP-9蛋白表達明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；針刀組與電針組比較TGF-β1蛋白表達較高，MMP-9蛋白表達較低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，Smad4蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3、表5。

表5 各組兔韌帶TGF-β1、Smad4和MMP-9蛋白比較

圖3 各組TGF-β1、Smad4及MMP-9的Western Blot檢測結果

3 討論

中醫(yī)學理論認為KOA形成的內部原因主要與肝、腎相關，肝腎陰陽失調、氣血虧虛，正氣不足、邪氣內生而引起骨性病變，外因可受風寒濕熱等邪氣導致瘀血內阻、筋脈不通和筋失濡養(yǎng)而致，臨床治療時多以補肝腎調氣血為主。但KOA的病因與發(fā)病機制較為復雜，需要不斷的探索與研究，從韌帶分子生物學來看，其病理學特征是韌帶及周圍軟組織粘連損傷、攣縮等導致膝關節(jié)無法發(fā)揮正常的生理活動。前期研究結果顯示，針刀干預對KOA韌帶生物力學有影響[7]，調控該力學特性的分子生物學機制還需要進一步的實驗來論證。本實驗在分子生物學理論的基礎上進一步探究針刀治療KOA的作用效應，其針刀的干預優(yōu)勢是對膝關節(jié)周圍韌帶組織進行松解，抑制外源性愈合所導致的粘連，消除內源性愈合的不利因素[8]，達到治愈的目的。其中，TGF-β1/Smads信號轉導通路在內源性愈合和外源性愈合起著非常重要的作用。

TGF-β1作為轉化生長因子，在細胞增殖分化、凋亡、粘連和遷移等多個細胞過程中發(fā)揮重要作用，它還是重要的致纖維化的細胞因子，有調節(jié)細胞生長分化、組織修復、參與炎癥和免疫等作用[9-10]。Smad4在信號傳輸途徑中處于中樞地位, 是唯一的共同介導型Smad[11]，Smad4蛋白的異常表達可引發(fā)TGF-β1蛋白表達的減少，導致周圍韌帶及軟組織的粘連[12]。MMP-9屬于基質金屬蛋白酶家族，作為TGF-β1/Smads信號通路的重要下游分子，過度表達會造成韌帶組織的破壞進而導致KOA的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)[13]，當阻斷TGF-β1/Smads信號通路在細胞核內的傳遞作用，其能夠刺激細胞外基質蛋白的產生，可以增加MMPs抑制劑的產生，阻止細胞外基質蛋白的降解，防止周圍組織粘連而產生瘢痕[14]，因此，可以通過抑制MMP-9的活性，促進膠原及蛋白多糖等基質合成，緩解軟骨退變，同時減少周圍組織粘連的增生，促進膝骨關節(jié)炎愈合。

針刀是朱漢章教授根據多年的臨床經驗將傳統(tǒng)針具與現(xiàn)代醫(yī)療刀具結合的產物，在治療膝骨關節(jié)炎等方面發(fā)揮了重要的作用，針刀醫(yī)學理論認為[15-16]，針刀通過刺激病變的經筋，松解周圍組織的粘連，使攣縮筋結的部分疏通，改善周圍軟組織的炎性病變，調節(jié)髕骨周圍產生的壓力及髕韌帶、交叉韌帶等力學平衡，加強筋肉的生理調節(jié)作用，恢復骨關節(jié)內環(huán)境的動態(tài)平衡，阻斷膝骨關節(jié)疾病的進一步發(fā)展。本實驗通過研究針刀及電針干預下治療膝骨關節(jié)炎，對兔膝關節(jié)韌帶組織HE染色發(fā)現(xiàn)，模型組膝關節(jié)韌帶的破壞程度最為嚴重，治療組經針刀及電針治療后略有改善，既可證明造模成功，又提示針刀及電針治療的有效性，造模后膝關節(jié)韌帶組織TGF-β1、Smad4 mRNA和蛋白表達減弱，MMP-9 mRNA和蛋白表達增強，韌帶組織有所損壞，造成膝關節(jié)炎的產生。針刀、電針干預可以進一步激活TGF-β1/Smad4信號通路，抑制MMP-9 mRNA和蛋白表達，從而促進韌帶功能的修復，且針刀的干預效果較優(yōu)于電針干預。本實驗結果提示，針刀干預通過調節(jié)TGF-β1/Smads信號通路的表達，可以促進關節(jié)韌帶的修復，減輕關節(jié)韌帶損傷。

綜上所述，針刀及電針通過對TGF-β1/Smads通路發(fā)揮調控作用，表明該治療手段可以間接抑制韌帶組織被破壞，通過調節(jié)TGF-β1、Smd4和MMP-9的分泌以保護受損的韌帶組織，進而緩解病情進展，改善預后。但還需要進一步擴大樣本量研究該治療手段對KOA的改善情況，可在細胞層面上探究針刀對KOA在其他相關信號通路中的影響作用，為針刀應用于臨床治療骨關節(jié)炎提供更具體的理論基礎與科學依據。