王繼雪 袁星星 于文慧 呂勃川 趙鋼

摘要 目的：分析當(dāng)歸活血湯治療下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的有效活性成分及靶點(diǎn)的藥理作用。方法：通過中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）篩選當(dāng)歸活血湯有效活性成分及靶點(diǎn)，運(yùn)用GeneCard及OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)獲取下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥（ASO）相關(guān)蛋白;通過String平臺(tái)對(duì)藥物-疾病靶蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，將所得到的當(dāng)歸活血湯-下肢ASO靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。結(jié)果：當(dāng)歸活血湯藥物有效活性成分234個(gè)，當(dāng)歸活血湯-下肢ASO作用靶點(diǎn)共26個(gè);PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-6、VEGFA、MMP-9、IL-10等可能是當(dāng)歸活血湯治療ASO的關(guān)鍵靶點(diǎn)。共獲得46條GO生物過程和167條相關(guān)信號(hào)通路，其中HIF-1、AGE-RAGE、IL-17、TNF等信號(hào)通路與下肢ASO的治療密切相關(guān)。結(jié)論：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究當(dāng)歸活血湯主要成分的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及其治療下肢ASO的作用機(jī)制，為進(jìn)一步對(duì)本病的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究提供新思路及科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 當(dāng)歸活血湯;下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥;靶點(diǎn);作用機(jī)制;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

Mechanism of Danggui Huoxue Decoction in the Treatment of Arteriosclerosis Obliterans of the Lower Extremities Based on Network Pharmacology

WANG Jixue1，YUAN Xingxing1，2，YU Wenhui3，LYU Bochuan3，ZHAO Gang3

（1 Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150040，China; 2 Heilongjiang Academy of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150006，China; 3 Department of Peripheral Vascular Diseases，the First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150040，China）

Abstract Objective：To analyze the active components of Danggui Huoxue Decoction in the treatment of arteriosclerosis obliterans（ASO） of the lower extremities and the pharmacological effect of its target.Methods：By TCMSP database，we screened the effective active ingredients and targets of Danggui Huoxue Decoction and we used GeneCard and OMIM database to obtain lower limb ASO-related proteins; we used String platform to construct PPI network for drug-disease target proteins，and used DAVID database to obtain Danggui Huoxue Decoction-lower ASO target for GO function and KEGG pathway enrichment analysis.Results：Danggui Huoxue Decoction had 234 active ingredients，and Danggui Huoxue Decoction-lower limb ASO had 26 targets; In PPI interaction network analysis it was found that IL-6，VEGFA，MMP-9，IL-10，etc.may be the treatment of Danggui Huoxue Decoction for the key target of ASO.A total of 46 GO biological processes and 167 related signal pathways were obtained，of which HIF-1，AGE-RAGE，IL-17，TNF and other signal pathways were closely related to the treatment of lower extremity ASO.Conclusion：Based on network pharmacology，the target network of the main components of Danggui Huoxue Decoction and its mechanism of action in the treatment of lower limb ASO are explored，which provides new ideas and scientific basis for further basic experimental research on this disease.

Keywords Dangguihuoxue Decoction; Lower extremity arteriosclerosis obliterans; Target; Mechanism of action; Network pharmacology

中圖分類號(hào)：R211;R289.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.23.010

下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥（Arteriosclerosis Obliterans，ASO）是外周血管疾病中最常見的一種因動(dòng)脈硬化斑塊所致的下肢動(dòng)脈閉塞性疾病。間歇性跛行是臨床早期出現(xiàn)的典型癥狀，隨著病情加重逐漸發(fā)展為靜息痛、嚴(yán)重者局部缺血部位出現(xiàn)大范圍皮膚潰爛[1]。隨著經(jīng)濟(jì)水平的不斷增長(zhǎng)，生命質(zhì)量的不斷提高，人口老齡化現(xiàn)象日益加劇，下肢ASO的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)[2]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前我國(guó)約有2 000萬人罹患本病，以老年男性者居多。研究顯示，70歲以上人群中發(fā)病率約為20%，而在70歲以下人群中則為3%～10%[3-4]。截至2010年，全球罹患下肢ASO的患者高達(dá)2.02億。隨著糖尿病、吸煙、高血壓、高脂血癥等高風(fēng)險(xiǎn)因素發(fā)病率的不斷上升[5]，使下肢ASO成為世界范圍內(nèi)備受關(guān)注的健康問題[6]。

當(dāng)歸活血湯最早見于明·《傷寒六書》，主要功效為活血化瘀。經(jīng)后世醫(yī)家辨病化裁，成為治療不同疾病的經(jīng)典方劑，分別記載于《眼科全書》《癥因脈治》《醫(yī)方考》等古籍中。目前，由當(dāng)歸、赤芍、川芎、丹參、黃芪、雞血藤、甘草組成的當(dāng)歸活血湯多用于治療中醫(yī)脫疽病。機(jī)制研究方面，當(dāng)歸活血湯具有抗炎、抑制血小板聚集、抗氧化應(yīng)激、改善下肢微循環(huán)等藥理作用[7]，目前其治療下肢ASO的藥效研究尚處于基礎(chǔ)的臨床觀察階段[8-9]，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為新興的中藥研究方法，可對(duì)中藥多成分、多靶點(diǎn)進(jìn)行整體研究，挖掘其潛在的作用機(jī)制?，F(xiàn)基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，探究當(dāng)歸活血湯治療下肢ASO的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 當(dāng)歸活血湯活性成分篩選

基于中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP），以“當(dāng)歸”“赤芍”“丹參”“黃芪”“川芎”“雞血藤”“甘草”為檢索詞，選取當(dāng)歸活血湯中所含中藥的化合成分。以口服生物利用度（OB）≥30%及類藥性（DL）≥0.18作為篩選條件，過濾獲取每味中藥的化合成分及對(duì)應(yīng)的藥物靶點(diǎn)。

1.2 藥物-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)可視化分析

利用GeneCard及OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)以“Arteriosclerosis occlusion”為檢索詞，收集下肢ASO靶點(diǎn)。運(yùn)用Interactivenn平臺(tái)上（http：//www.interactivenn.net/）將藥物活性成分-疾病共同蛋白進(jìn)行提取，所得交集即為Drug-Disease靶點(diǎn)。通過Cytoscape 3.7.1軟件對(duì)Drug-Disease進(jìn)行可視化網(wǎng)絡(luò)分析。

1.3 構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

將Drug-Disease結(jié)果傳至String平臺(tái)進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析。設(shè)定物種為“Homo sapiens”，設(shè)定最低互動(dòng)分?jǐn)?shù)為0.400[10]。運(yùn)用Cytoscape 3.7.1軟件進(jìn)行可視化分析。

1.4 GO功能及KEGG富集分析

將Drug-Disease結(jié)果輸入至DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，分別通過OmicShare平臺(tái)（http：//www.omicshare.com/）和Cytoscape 3.7.1軟件對(duì)GO和KEGG富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸活血湯活性成分的篩選

共檢索得到當(dāng)歸活血湯所有活性成分234個(gè)，根據(jù)OB值將各藥物排名前5的有效活性成分基本信息見表1。

2.2 藥物-疾病靶點(diǎn)（Drug Disease Target，DDT）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化

共得到當(dāng)歸活血湯中146個(gè)藥物靶點(diǎn)，通過GeneCard，OMIM上檢索到關(guān)于下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的617個(gè)靶點(diǎn)，將二者進(jìn)行交集處理，共得到26個(gè)藥物疾病靶點(diǎn)。見圖1。利用Cytoscape 3.7.1軟件對(duì)DDT進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化。見圖2。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及可視化

通過String平臺(tái)對(duì)得到的26個(gè)藥物疾病靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，然后利用Cytoscape軟件對(duì)PPI結(jié)果行網(wǎng)絡(luò)可視化分析。PPI網(wǎng)絡(luò)最終得到共包含26個(gè)節(jié)點(diǎn)，208條邊。根據(jù)Degree值對(duì)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行排序，排名前5的靶點(diǎn)為IL-6、VEGFA、MMP-9、IL-10、MMP-2。見圖3。

2.4 GO富集分析

將所得到的26個(gè)藥物疾病靶點(diǎn)，通過DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO功能富集分析，共得到46條功能注釋。通過OmicShare平臺(tái)對(duì)BP、MF和分子功能排名，根據(jù)P值和富集靶點(diǎn)數(shù)靠前的GO富集分析結(jié)果進(jìn)行排序。見圖4，表2。

2.5 KEGG富集分析

通過DAVID平臺(tái)對(duì)26個(gè)DDT進(jìn)行KEGG富集分析，共得到167條富集通路，富集排名靠前的通路主要有HIF-1、AGE-RAGE、IL-17、TNF等信號(hào)通路密切相關(guān)。見圖5，表3。通過Cytoscape 3.7.1軟件對(duì)DDT與富集通路進(jìn)行可視化網(wǎng)絡(luò)。見圖6。

3 討論

下肢ASO是全身動(dòng)脈硬化在肢體的局部表現(xiàn)。動(dòng)脈粥樣硬化的病因尚不明確，醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制與血栓形成、脂質(zhì)浸潤(rùn)、內(nèi)膜損傷、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、氧化應(yīng)激、血管平滑肌細(xì)胞激活等有關(guān)。目前，越來越多的研究證實(shí)炎癥反應(yīng)在ASO過程中扮演重要角色，這也是現(xiàn)階段下肢ASO研究的重要切入點(diǎn)之一。通過對(duì)當(dāng)歸活血湯治療下肢ASO的成分-靶點(diǎn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，本方中所含藥物包括多種化學(xué)成分，且不同成分可以作用于多個(gè)靶點(diǎn)，充分體現(xiàn)中藥組方多成分、多靶點(diǎn)相互協(xié)同作用。

本研究通過收集、篩選當(dāng)歸活血湯中所含藥物，共得到234個(gè)活性成分，主要有芒柄花素、川芎哚、丹參酮ⅡA等能夠預(yù)防及延緩ASO的形成?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，芒柄花素具有降脂、抗脂質(zhì)過氧化，改善AS病變[11];此外，芒柄花素還能夠抑制平滑肌細(xì)胞增殖及遷移。趙培等[12]通過研究芒柄花素上調(diào)SR-BI蛋白表達(dá)，抑制主動(dòng)脈壁泡沫細(xì)胞形成及平滑肌細(xì)胞增殖，達(dá)到預(yù)防和延緩ASO的形成和發(fā)展。血小板聚集和血栓形成是ASO形成的主要病理基礎(chǔ)。唐剛?cè)A等[13]研究發(fā)現(xiàn)川芎哚（川芎Ⅲ號(hào)堿）具有抗凝、降低全血黏度及紅細(xì)胞聚集、改善血液流變學(xué)及輕度增強(qiáng)紅細(xì)胞變形的作用，尋找抗血小板聚集和抗血栓形成的藥物對(duì)于防治ASO意義重大[14]。符杰等[15]研究表明丹參酮ⅡA可通過減少大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌ADMA，抑制eNOS降解，促進(jìn)NO分泌，達(dá)到抑制血管收縮，預(yù)防ASO形成。進(jìn)一步對(duì)活性成分靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，得出146個(gè)對(duì)應(yīng)的潛在靶點(diǎn)，通過檢索相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)共獲得與下肢ASO疾病相關(guān)的靶點(diǎn)617個(gè)，利用VENNY網(wǎng)絡(luò)篩選出當(dāng)歸活血湯與下肢ASO共同作用靶點(diǎn)26個(gè)，體現(xiàn)了當(dāng)歸活血湯的整體協(xié)同作用。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析顯示，當(dāng)歸活血湯中藥物作用的靶蛋白與下肢ASO的作用靶蛋白，二者之間存在復(fù)雜的作用關(guān)系。通過IL-6、STAT3、VEGFA、MMP-9、IL-10、MMP-2，炎癥介質(zhì)、血管生長(zhǎng)因子、黏附分子、多種酶等靶點(diǎn)相互作用，起到抗動(dòng)脈硬化的作用。諸多研究提示斑塊內(nèi)活動(dòng)性炎癥與斑塊的穩(wěn)定性相關(guān)[16]。IL-6是一種具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的炎癥介質(zhì)，尤其在纖維帽及粥樣斑塊高表達(dá)水平，參與ASO及斑塊破裂的全過程，通過與受體結(jié)合可誘導(dǎo)STAT3的活化。盧素宏等[17]研究證實(shí)，IL-6可激活I(lǐng)L-6/STAT3信號(hào)通路傳導(dǎo)，介導(dǎo)組織炎癥和細(xì)胞增殖。ICAM-1、VCAM-1等黏附分子參與AS慢性炎癥反應(yīng)全過程，聚集反應(yīng)增強(qiáng)，在影響斑塊形成的同時(shí)還影響斑塊穩(wěn)定性。IL-6還可以刺激基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP），其升高分解了EMC的核心物質(zhì)膠原纖維，使纖維帽變薄，誘導(dǎo)動(dòng)脈斑塊破裂。故認(rèn)為MMPs的增多可嚴(yán)重影響斑塊穩(wěn)定性。MMP-2和MMP-9同屬于基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinases，MMPs）家族成員，在Endothelin-1、IL-1β、Ang-Ⅱ、TNF-α、缺氧等因素的誘導(dǎo)下，明膠酶MMP-2和MMP-9不斷上調(diào)，酶解ECM中的Ⅳ型膠原，致其組織形態(tài)發(fā)生改變[18]。哈略和趙百孝[19]通過積極干預(yù)降低主動(dòng)脈內(nèi)MMP9含量，達(dá)到促進(jìn)斑塊穩(wěn)定性的效果[20]。此外，MMP-2能夠加速細(xì)胞外基質(zhì)降解，在斑塊形成后促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，有利于單核巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及淋巴細(xì)胞向內(nèi)膜下遷移，增加ASO斑塊的易損性[21-22]。而IL-10是一種多效單鏈糖蛋白，其抗炎機(jī)制在ASO斑塊的形成和穩(wěn)定中起到保護(hù)作用[23]，IL-10較IL-4突出的一點(diǎn)即其可通過抑制核因子κB發(fā)揮抗炎機(jī)制，但其抗凋亡機(jī)制是否起到穩(wěn)定AS斑塊的作用尚有爭(zhēng)議。同樣，動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和功能失調(diào)也參與ASO發(fā)生發(fā)展，秦臻和黃水清[24]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯可通過促進(jìn)內(nèi)皮受損后VEGF及SDF-1的釋放，誘導(dǎo)EPCs增殖，VEGF可使受損缺血部分EPCs大量聚集，促進(jìn)血管新生。黃水清等[25]通過調(diào)控與炎癥介質(zhì)關(guān)系密切的核因子κB及P38MAPK通路保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞。以上靶蛋白的相互協(xié)同作用、可能是當(dāng)歸活血湯治療下肢ASO的主要作用機(jī)制。

我們對(duì)當(dāng)歸活血湯治療下肢ASO進(jìn)行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸活血湯通過多靶點(diǎn)、多結(jié)構(gòu)、多形式參與生物學(xué)進(jìn)程，主要涉及細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)錄因子活性、抗氧化活性等，與下肢ASO發(fā)生發(fā)展過程中的炎癥反應(yīng)[26]、免疫反應(yīng)[27]、氧化應(yīng)激損傷[28]等相互作用，驗(yàn)證出網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的合理性和可靠性。KEGG通路分析結(jié)果顯示，當(dāng)歸活血湯治療下肢ASO主要涉及HIF-1、AGE-RAGE、IL-17等與炎癥、氧化應(yīng)激相關(guān)的通路，本研究發(fā)現(xiàn)IL-6、VEGFA、STAT3等基因主要富集在HIF-1信號(hào)通路，HIF-1作為機(jī)體微環(huán)境缺氧的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在缺血缺氧的條件下，HIF-1合成增加，并通過VEGF、Ang-Ⅱ合成等方式促進(jìn)血管形成。IL-6、VEGFA、VCAM-1、ICAM-1、MMP-2、STAT3等主要富集于AGE-RAGE信號(hào)通路上，RAGE是導(dǎo)致ASO發(fā)生的重要膜受體[29]。AGEs和受體相互作用，可引起氧化應(yīng)激等反應(yīng)，導(dǎo)致血管通透性增加、管壁增厚、脂質(zhì)蛋白沉積，并可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化。郭曉華等[30]實(shí)驗(yàn)證明AGE可通過與RAGE結(jié)合引發(fā)氧化應(yīng)激，引起細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高。莫中成等[31]發(fā)現(xiàn)AGEs誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VCAM-1和ICAM-1，可能是其促動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要機(jī)制。AGE與RAGE結(jié)合，可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激。MMP9、IL-6、IL-4主要富集于IL-17信號(hào)通路，國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)IL-17A在炎癥發(fā)生過程中起著重要作用[32]。研究認(rèn)為IL-17A的增多促進(jìn)下肢ASO的發(fā)生和發(fā)展[33]，但Danzaki等[34]通過對(duì)ApoE-/-小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)認(rèn)為IL-17A表達(dá)水平的缺陷是促進(jìn)動(dòng)脈粥樣斑塊進(jìn)展的主要誘因和條件。IL-6、MMP-9、ICAM-1、VCAM-1等均富集于TNF信號(hào)通路，TNF-α作為一種強(qiáng)效炎癥介質(zhì)，參與多種細(xì)胞行為。TNF-α由單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生后直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞，并通過多重路徑誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和凋亡，影響ASO斑塊的穩(wěn)定性。付建玉[35]在研究TNF-α的缺失對(duì)小鼠AS的影響發(fā)現(xiàn)，TNF-α的缺失會(huì)降低血脂水平，使炎癥反應(yīng)減輕，延緩ASO的形成與發(fā)展[36]。再次說明多生物途徑、多信號(hào)通路相互協(xié)同作用是當(dāng)歸活血湯治療下肢ASO主要的機(jī)制研究基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

當(dāng)歸活血湯通過234個(gè)活性成分作用于26個(gè)靶點(diǎn)，167條信號(hào)通路，主要通過抗炎、抗氧化應(yīng)激、抑制平滑肌細(xì)胞的增殖、降解細(xì)胞外基質(zhì)等途徑，穩(wěn)定ASO斑塊、保護(hù)內(nèi)膜等協(xié)同作用來治療下肢ASO，為深入探討當(dāng)歸活血湯治療下肢ASO的效應(yīng)機(jī)制提供基礎(chǔ)。

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（2020-07-01收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）