(蘭 艷 隋曉東 王 錦 吳超越 丁春邦 李 天

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/作物生理生態(tài)及栽培四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1，成都 611130)

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2，雅安 625014)

低谷蛋白水稻是指可吸收蛋白 (清蛋白、球蛋白、谷蛋白之和) 含量低于4%的具有輔助療效的功能型水稻品種[1]。食用等量的低谷蛋白大米后，人體不會(huì)因攝入過量熱量而使血糖、血脂升高，能有效預(yù)防、輔助治療糖尿病和腎病[2]。水稻籽粒中含有7%～10%的蛋白質(zhì)，一般糙米的蛋白質(zhì)含量約為8%，精米約7%[3, 4]。根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解性，可將其分為四類：水溶性的清蛋白、鹽溶性的球蛋白、醇溶性的醇溶蛋白和堿溶性的谷蛋白[5]。由此，稻米中組分蛋白的提取通常采用連續(xù)提取法，即首先用水提取得到清蛋白，其殘?jiān)孟←}溶液提取得到球蛋白，再用75%乙醇提取得到醇溶蛋白，最后用堿溶液提取得到谷蛋白[6]。然而，稻米中的四種蛋白質(zhì)含量差異很大，且同一種蛋白質(zhì)在不同品種中含量也有差異[7, 8]。據(jù)報(bào)道，普通稻米胚乳中各類蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為：清蛋白2%～5%、球蛋白2%～10%、醇溶蛋白1%～5%、谷蛋白75%～90%[5]。而低谷蛋白稻米中各蛋白組分的含量與普通稻米相差甚遠(yuǎn)[9, 10]，普通稻米的提取液濃度是否適用還未知；此外，蛋白的提取率還受溫度、料液比、提取時(shí)間等因素影響[11]。因此本實(shí)驗(yàn)在連續(xù)提取法的基礎(chǔ)上，篩選最適提取液濃度并利用Design-Expert (RSM) 軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)條件，優(yōu)化低谷蛋白稻米各組分蛋白的提取時(shí)間、料液比、提取溫度及提取次數(shù)，為低谷蛋白功能稻的綜合評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取低谷蛋白稻米(D105)為材料，稻谷收獲風(fēng)干并存放三個(gè)月，加工成精米粉碎過篩后烘干供測(cè)試用。

G250、牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、無水乙醇、氯化鈉 (AR)、磷酸 (AR)、氫氧化鈉 (AR)。

1.2 儀器與設(shè)備

YB-750A粉碎機(jī)，THZ-82A恒溫水浴振蕩搖床，Thermo離心機(jī)，Analytik Jena Specord 200 Plus雙光束紫外分光光度儀，BT-124S型電子天平。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 提取劑濃度篩選實(shí)驗(yàn)

以各組分蛋白含量為指標(biāo)，考察提取劑濃度：球蛋白提取劑氯化鈉溶液(0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mol/L)、醇溶蛋白提取劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為(70%、75%、80%、85%、90%)、谷蛋白提取劑氫氧化鈉溶液(0.02、0.04、0.06、0.08、0.09、0.1 mol/L) 對(duì)各組分蛋白含量的影響，并固定溫度35℃，時(shí)間30 min，提取3次。

1.3.2 組分蛋白含量測(cè)定

稻米中組分蛋白提取量的測(cè)定采用G250顯色法，取待測(cè)液1 mL，加4 mL G250試劑，搖勻，靜置5 min，于595 nm檢測(cè)吸光值。以牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液濃度為x軸、吸光度為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按公式計(jì)算各組分蛋白含量：

蛋白含量=

1.3.3 稻米中各組分蛋白的提取

采取連續(xù)提取法對(duì)稻米組分蛋白進(jìn)行提取，具體步驟為：準(zhǔn)確稱取精米粉0.300 0 g，按設(shè)定料液比例加入超純水，恒溫水浴搖床(190 r/min)振蕩浸提后6 000轉(zhuǎn)離心10 min，收集多次提取的上清液合并定容，為清蛋白的待測(cè)液；對(duì)提取過清蛋白的樣品中再加入氯化鈉溶液，重復(fù)上述提取步驟，為球蛋白提取液；依次對(duì)提取過球蛋白的樣品加入乙醇溶液，提取醇溶蛋白，對(duì)提取過醇溶蛋白的樣品中加入氫氧化鈉溶液提取谷蛋白；并按1.3.2 方法測(cè)定并計(jì)算稻米中各組分蛋白的含量。

1.3.4 單因素實(shí)驗(yàn)

以各組分蛋白含量為指標(biāo)，分別考察料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，固定溫度35 ℃，時(shí)間40 min，提取3次)、提取溫度(25、30、35、40、45 ℃，固定料液比1∶20，時(shí)間40 min，提取3次)、提取時(shí)間(20、40、60、80、100 min，固定料液比1∶20，溫度35 ℃，提取3次)、提取次數(shù)(2、3、4、5、6，固定料液比1∶20，溫度35 ℃，時(shí)間40 min)、4個(gè)因素對(duì)各組分蛋白含量的影響。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 11 (RSM)軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)條件，選用Box-Behnken (BB) 模型，以各組分蛋白含量為響應(yīng)值，料液比(A)、提取溫度(B)、提取時(shí)間(C)、提取次數(shù)(D) 為自變量，設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) (表1)。

表1 因素水平編碼表

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010、SPSS 17.0、Design expert 11、SAS 9.4對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果和分析

2.1 提取劑濃度篩選

2.1.1 氯化鈉濃度對(duì)球蛋白含量的影響

由圖1可知，球蛋白含量隨著氯化鈉溶液濃度的增大呈先增后降的變化，當(dāng)氯化鈉濃度為0.6 mol/L時(shí)，含量達(dá)到6.29 mg/g。這可能是較高濃度的鹽離子造蛋白質(zhì)的部分沉淀，降低了球蛋白的提取量。因此，選擇氯化鈉濃度為0.6 mol/L。

圖1 不同提取劑濃度對(duì)各組分蛋白含量的影響

2.1.2 乙醇濃度對(duì)醇溶蛋白含量的影響

由圖1可知，醇溶蛋白含量隨著乙醇濃度的增大呈先增后降的變化趨勢(shì)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為 80% 時(shí)，含量達(dá)到4.13 mg/g。這可能是較高乙醇濃度造成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)的破壞，造成部分沉淀，從而降低了醇溶蛋白的提取量。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%。

2.1.3 氫氧化鈉濃度對(duì)谷蛋白含量的影響

由圖1可知，谷蛋白含量隨著氫氧化鈉濃度的增大呈先增后降的變化趨勢(shì)，當(dāng)氫氧化鈉濃度為 0.04 mol/L 時(shí)，含量達(dá)到14.15 mg/g。這可能是氫氧化鈉會(huì)與蛋白質(zhì)發(fā)生一定反應(yīng)，在較高濃度下會(huì)降低蛋白質(zhì)的溶解性，從而降低了谷蛋白的提取量。因此，選擇氫氧化鈉濃度為0.04 mol/L。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 料液比對(duì)各組分蛋白含量的影響

由圖2可知，隨著料液比的增加，四種組分蛋白提取量增加，清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白分別在料液比為1∶20，1∶20，1∶25，1∶15達(dá)到最大值，分別為5.59，15.27，4.19，20.26 mg/g。當(dāng)提取料液比超過最大提取值的料液比時(shí)，四種組分蛋白提取量逐漸降低；說明此時(shí)，稻米四種蛋白已基本溶出，料液比繼續(xù)增加，可溶性雜質(zhì)增多，降低蛋白對(duì)溶劑的親和力，降低提取量[12]。因此，響應(yīng)面分析時(shí)清蛋白和球蛋白選擇料液比：1∶15、1∶20、1∶25；醇溶蛋白料液比：1∶20、1∶25、1∶30；谷蛋白料液比：1∶10、1∶15、1∶20。

圖2 料液比對(duì)各組分蛋白含量的影響

2.2.2 提取溫度對(duì)各組分蛋白含量的影響

由圖3可知，當(dāng)溫度為25～40 ℃時(shí)，四種組分蛋白提取量增加，清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白都在35 ℃達(dá)到最大值，分別為4.59、10.29、2.49 mg/g，谷蛋白在40 ℃達(dá)到最大值為19.68 mg/g。當(dāng)提取繼續(xù)增加，四種組分蛋白提取量逐漸降低。這可能是由于實(shí)驗(yàn)中一定的溫度 (35、40 ℃)可以加快分子間的運(yùn)動(dòng)，提高蛋白溶解量，但超過一定溫度 (35、40 ℃)時(shí)，可能會(huì)影響蛋白的結(jié)構(gòu)，使蛋白從溶液中析出，降低提取量[13]。因此，響應(yīng)面分析時(shí)選擇清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白提取溫度為：30、35、40 ℃；谷蛋白提取溫度為：35、40、45 ℃。

圖3 溫度對(duì)各組分蛋白含量的影響

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)各組分蛋白含量的影響

由圖4可知，清蛋白和醇溶蛋白提取量隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)先增加后降低，在40 min達(dá)到最大值，分別為4.49、2.49 mg/g。谷蛋白和球蛋白的提取量則隨提取時(shí)間延長(zhǎng)下降，在提取時(shí)間為20 min時(shí)達(dá)到最大值分別為20.44、9.26 mg/g。當(dāng)清蛋白和醇溶蛋白提取時(shí)間超過40 min；谷蛋白和球蛋白超過20 min時(shí)，四種組分蛋白提取量逐漸降低。這可能在40、20 min時(shí)稻米四種蛋白已基本溶出，提取時(shí)間繼續(xù)增加，蛋白質(zhì)發(fā)生部分的沉淀，降低提取量[12]。因此，響應(yīng)面分析時(shí)選擇清蛋白和醇溶蛋白提時(shí)間為：20、40、60 min；球蛋白提取時(shí)間為：10、20、30 min；谷蛋白提取時(shí)間為：10、20、30 min。

圖4 提取時(shí)間對(duì)各組分蛋白含量的影響

2.2.4 提取次數(shù)對(duì)各組分蛋白含量的影響

由圖5可知，清蛋白、球蛋白和谷蛋白提取量隨提取次數(shù)增加先升后降，在提取次數(shù)為3次時(shí)達(dá)到最大值，分別為 4.59、10.29、21.79 mg/g。醇溶蛋白提取量則隨提取次數(shù)增加而降低，當(dāng)提取次數(shù)為 2次時(shí)含量達(dá)到最大值為1.70 mg/g。當(dāng)清蛋白、球蛋白和谷蛋白提取超過3 次，醇溶蛋白提取超過2次時(shí)，四種組分蛋白提取量逐漸降低；此時(shí)稻米四種蛋白已基本溶出，隨著提取次數(shù)繼續(xù)增加，其他物質(zhì)溶出量增加，使得最終樣品液中的蛋白發(fā)生部分的析出，降低提取量[12]。因此，響應(yīng)面分析時(shí)選擇清蛋白、球蛋白、谷蛋白提取次數(shù)為：2、3、4；醇溶蛋白提取次數(shù)為：1、2、3。

圖5 提取次數(shù)對(duì)各組分蛋白含量的影響

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬確定的最佳條件，以稻米中各蛋白組分對(duì)應(yīng)的提取條件：料液比(A)、提取溫度(B)、提取時(shí)間(C)和提取次數(shù)(D) 為自變量，以為響應(yīng)值 (組分蛋白的含量)為因變量，設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

對(duì)表2中的結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸擬合，得到稻米中各蛋白組分含量對(duì)其相應(yīng)提取的料液比(A)、提取溫度(B)、提取時(shí)間(C)、提取次數(shù)(D) 的二次多項(xiàng)回歸方程模型結(jié)果如下：

表2 響應(yīng)面分析方案

清蛋白：Y=1.581 3A+0.781 5B+0.005 5C+3.119 2D-0.012 6AB+0.004 1AC-0.061 5AD+0.001 9BC+0.012 0BD+0.004 4CD-0.027 2A2-0.001 0B2-0.002 0C2-0.385 4D2-29.990 4

球蛋白：Y=0.060 8A-0.605 8B+0.249 2C+0.089 2D+0.200 0AB-0.335 0AC+0.247 5AD+0.020 0BC+0.407 5BD+0.282 5CD-0.552 5A2-0.835 0B2-0.785 0C2-0.825 0D2+10.18

醇溶蛋白：Y=0.1575-0.019 2B-0.011 7C+0.005D-0.120 0AB-050 75AC+0.085 0AD+0.037 5BC+0.055BD+360 0CD-0.566 6A2-0.251 6B2-0.405 4C2-0.322 9D2+2.33

谷蛋白：Y=0.696 7A-0.391 7B+0.454 2C+0.679 2D-0.002 5AB+0.745 0AC-0.302 5AD+0.790 0BC+0.122 5BD-0.027 5CD-2.47A2-0.186B2-1.15C2-2.03D2+23.10

2.3.2 回歸模型的方差分析與顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert 11軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析 (analysis of variance,ANOVA)，確定各因素對(duì)稻米組分蛋白提取的影響程度，同時(shí)也檢驗(yàn)回歸方程的失擬項(xiàng)。從表3～表6可知，經(jīng)RSM四種組分蛋白獲得的模型極顯著(P<0.01)，失擬項(xiàng)P值為0.103 8(清蛋白)、0.344 1(球蛋白)、0.123 4(醇溶蛋白)、0.271 8(谷蛋白)，P值均不顯著(P>0.05)；相關(guān)系數(shù)R2=0.896 9(清蛋白)、0.837 4(球蛋白)、0.856 9(醇溶蛋白)、0.900 0(谷蛋白)，說明該模型擬合度較好。表明建立的數(shù)學(xué)模型成功擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，在一定范圍內(nèi)對(duì)稻米中各組分蛋白提取量具有較好的預(yù)測(cè)性。

表3 清蛋白響應(yīng)面回歸模型方差分析

表4 球蛋白響應(yīng)面回歸模型方差分析

表5 醇溶蛋白響應(yīng)面回歸模型方差分析

續(xù)表5

表6 谷蛋白響應(yīng)面回歸模型方差分析

各因素對(duì)稻米各組分蛋白含量顯著性分析可以看出，清蛋白：A、AC、B、C、D、AD、A2、B2、C2、D2的P值小于0.01，AB的P值小于0.05，且根據(jù)F值的大小，可以得出四個(gè)因素對(duì)清蛋白提取量的影響大小為C>A>B>D；球蛋白：B、A2、B2、C2、D2的P值小于0.01，C、BD的P值小于0.05，且根據(jù)F值的大小可以得出四個(gè)因素對(duì)球蛋白的提取量的影響大小為B>C>D>A，且D、A對(duì)球蛋白的提取的影響未達(dá)到顯著水平，表明D、A對(duì)球蛋白的提取影響較B、C小；醇溶蛋白：A、CD、A2、B2、C2、D2的P值小于0.01，且根據(jù)F值的大小可以得出四個(gè)因素對(duì)球蛋白的提取量的影響大小為A>B>C>D，且D、B、C對(duì)醇溶蛋白的提取的影響未達(dá)到顯著水平，表明D、B、C對(duì)醇溶蛋白的提取影響較A?。还鹊鞍祝篈、D、A2、B2、C2、D2的P值小于0.01，AC、BC、B、C的P值小于0.05，且根據(jù)F值的大小可以得出四個(gè)因素對(duì)谷蛋白的提取量的影響大小為A>D>C>B。各模型的顯著性分析也表明各因素對(duì)提取的組分蛋白含量的影響并不是一般的線性關(guān)系。

2.3.3 響應(yīng)面分析

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert 11軟件作圖，得到四種組分蛋白在不同提取條件下四個(gè)因素交互作用的響應(yīng)面，可直觀反映各因素的交互作用。響應(yīng)曲面越平緩反應(yīng)響應(yīng)值對(duì)于因素的改變?cè)讲幻舾校粗?，響?yīng)面越陡峭，響應(yīng)值對(duì)于因素的改變?cè)矫舾?。清蛋白：料液比和提取溫度、提取次?shù)、提取時(shí)間的交互曲面陡峭，交互作用顯著，提取溫度與提取時(shí)間，提取次數(shù)，交互面平緩，交互作用不顯著，提取時(shí)間和提取次數(shù)交互面也平緩，交互作用不顯著，與方差分析結(jié)果一致。球蛋白：提取溫度和提取次數(shù)的，交互曲面陡峭，交互作用顯著，其余各因素間的交互曲面平緩，交互作用不顯著。與方差分析結(jié)果一致。醇溶蛋白：提取時(shí)間和提取次數(shù)的交互曲面陡峭，交互作用顯著，其余各項(xiàng)的交互曲面平緩，交互作用不顯著，與方差分析結(jié)果一致。谷蛋白：料液比與提取時(shí)間、提取溫度與提取時(shí)間、提取時(shí)間與提取次數(shù)的交互曲面陡峭，交互作用顯著，其余各項(xiàng)的交互曲面平緩，交互作用不顯著，與方差分析結(jié)果一致。隨著各因素值的增大，響應(yīng)值逐漸增大，但當(dāng)響應(yīng)值達(dá)到最大值之后，隨著各因素值的繼續(xù)增高，響應(yīng)值則逐漸降低。

2.3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)所建立的模型，得到各組分蛋白的提取最佳條件分別為，清蛋白∶料液比1∶21.64，提取溫度 31.57 ℃，提取時(shí)間 43.42 min，提取次數(shù) 3.06次；球蛋白：料液比1∶19.65，提取溫度 33.1 ℃，提取時(shí)間 21.6 min，提取次數(shù)2.97次；醇溶蛋白∶料液比1∶20.75，提取溫度 34.63 ℃，提取時(shí)間39.6 min，提取次數(shù) 2.01次；谷蛋白：料液比1∶15.83，提取溫度 34.7 ℃，提取時(shí)間 22.35 min，提取次數(shù) 3.15次。在此條件下各組分蛋白的預(yù)測(cè)提取質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4.34、10.31 、2.34 、23.27 mg/g。

考慮到實(shí)驗(yàn)操作的可行性，將優(yōu)化的提取條件修改為：清蛋白∶料液比1∶22、提取溫度31.6 ℃、提取時(shí)間43 min，提取次數(shù) 3次；球蛋白∶料液比1∶20、提取溫度33.1 ℃、提取時(shí)間22 min，提取次數(shù)3次；醇溶蛋白∶料液比1∶21、提取溫度34.6 ℃、提取時(shí)間40 min，提取次數(shù) 2次；谷蛋白∶料液比1∶16、提取溫度34.7 ℃、提取時(shí)間22 min，提取次數(shù) 3次。在此條件下進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，稻米各組分蛋白的平均提取量分別為，清蛋白：4.26 mg/g，球蛋白：9.76mg/g，醇溶蛋白：2.27 mg/g，谷蛋白：23.60 mg/g，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為 0.018 7(清蛋白)，0.056 3(球蛋白)，0.030 8(醇溶蛋白)，0.014(谷蛋白)，表明響應(yīng)面法優(yōu)化所得提取條件較好，具有應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

提取劑濃度篩選結(jié)果表明，稻米球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白隨著提取劑濃度的增加呈先增后降的趨勢(shì)；球蛋白提取最適提取氯化鈉溶液濃度為0.6 mol/L、醇溶蛋白最適乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、谷蛋白的最適提取濃度為0.04 mol/L。

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，4種組分蛋白的提取量均隨著料液比的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；清蛋白的提取量隨著溫度的升高呈現(xiàn)先升高后平緩下降的趨勢(shì)，而其余3種蛋白的提取量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；球蛋白和谷蛋白的提取量隨著時(shí)間的增加呈現(xiàn)平緩下降的趨勢(shì)，而醇溶蛋白和清蛋白則呈現(xiàn)先升高后平緩降低的趨勢(shì)；醇溶蛋白的提取量隨著提取次數(shù)的增加呈現(xiàn)平緩下降的趨勢(shì)，其余3種蛋白的提取量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。

通過Design-Expert 11軟件和Box-Behnken(BB)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，得到清蛋白最佳提取工藝：料液比1∶22、提取溫度31.6 ℃、提取時(shí)間43 min，提取次數(shù)3次，球蛋白∶料液比1∶20、提取溫度33.1 ℃、提取時(shí)間22 min，提取次數(shù) 3次，醇溶蛋白∶料液比1∶21、提取溫度34.6 ℃、提取時(shí)間40 min，提取次數(shù) 2次，谷蛋白∶料液比1∶16、提取溫度34.7 ℃、提取時(shí)間22 min，提取次數(shù) 3次。結(jié)果表明，相比普通稻米提取，該方法不僅提取率高，還節(jié)約了提取成本和提取時(shí)間。