黨少華，徐敏，胡金月，孫永強(qiáng)

(鄭州市第三人民醫(yī)院 a.乳腺甲狀腺外科；b.內(nèi)分泌科，河南 鄭州 450000)

乳腺癌已位居我國女性惡性腫瘤發(fā)病的首位，且其發(fā)病率呈不斷上升趨勢[1-2]。近年來，乳腺癌的早期診斷與治療水平逐漸提高，在一定程度上降低了乳腺癌的病死率，但由于乳腺癌發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，仍有部分患者發(fā)生復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。因此，從分子層面深入探討乳腺癌的發(fā)生機(jī)制可為乳腺癌的治療與控制復(fù)發(fā)提供有效靶點。環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類共價閉合的內(nèi)源性非編碼RNA，具有組織特異性及較高的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，可吸收多達(dá)120個microRNA(miRNA)作為競爭性內(nèi)源性RNA[3-5]。研究證實，在功能層面上，疾病相關(guān)的miRNA可以與circRNA相互作用，從而影響下游靶基因功能，在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起到了重要的調(diào)控作用[6-7]，其中circRNA在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著尤為重要的作用。hsa_circ_0026344是一種新發(fā)現(xiàn)的circRNA，在乳腺癌細(xì)胞中的作用尚不明確。本研究通過觀察hsa_circ_0026344在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)及其在乳腺癌進(jìn)展中的作用，揭示hsa_circ_0026344影響乳腺癌細(xì)胞生長的生物學(xué)行為，為circRNA分子靶向治療的研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞系及T47D人乳腺癌細(xì)胞系購自Sigma公司，購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。18對乳腺癌組織及癌旁正常組織取自鄭州市第三人民醫(yī)院，乳腺癌組織和正常組織均經(jīng)病理證實，其中3個Luminl A型和10個Luminl B型，3個HER-2陽性，2個三陰型。18例患者中7例患者死亡，隨訪時間為24～131個月，中位隨訪時間68個月。樣本組織均先在液氮中進(jìn)行處理，處理完畢后再送至-80 ℃冰箱內(nèi)進(jìn)行冷藏。本研究經(jīng)鄭州市第三人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署書面知情同意書。采用杭州四季青公司的胎牛血清及RPMI-1640培養(yǎng)基，上海安亭科學(xué)儀器廠的Anke TDL-40B型臺式離心機(jī)，美國Thermo HERAcell 240二氧化碳培養(yǎng)箱，Costar公司Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板，武漢博士德生物工程有限公司細(xì)胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)，美國Bio-Rad公司的電泳儀及凝膠成像分析系統(tǒng)，日本的KUBOTA KA-2200臺式離心機(jī)，美國Thermo公司的Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將含有體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI -1640培養(yǎng)基對MDA-MB-231與T47D細(xì)胞置于條件為37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時，使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染MDA-MB-231與T47D細(xì)胞系，24、48 h后收獲細(xì)胞。將hsa_circ_0026344過表達(dá)的編碼序列轉(zhuǎn)入PLCDH-cir載體(中國廣州，RiboBio)，并構(gòu)建慢病毒載體。

1.2.2qRT-PCR檢測 采用TRIzol試劑從正常人乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A和相關(guān)乳腺癌細(xì)胞及乳腺癌組織中提取總RNA，使用酶標(biāo)儀檢測其濃度和純度。將RNA反轉(zhuǎn)錄成為cDNA。使用美國Bio-Rad公司的ABI 7500 PCR實時熒光定量儀檢測hsa_circ_0026344在乳腺癌組織和細(xì)胞中的相對表達(dá)水平。該研究所用的特異性引物購自GenePharma公司(中國上海)，序列如下。以GAPDH為內(nèi)參，GAPDH上游引物序列：5’-TTGCCCTCAACGACCACT-TT-3’，下游引物序列：5’-TGGTCCAGGGGTCTTACTCC-3’。hsa_circ_0026344上游引物序列：5’-CTCAGCCTCTAGCATAAGCTC-3’，下游引物序列：5’-AGGCAAGAGAATATATTTGAAC-3’。首先以cDNA為模板，95 ℃預(yù)變性3 min，然后95 ℃變性5 s，接著給予60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s的條件下擴(kuò)增40個循環(huán)。給每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔，采用2-△△CT法表示hsa_circ_0026344的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。

1.2.3CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 在轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后，將各組細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液加入到96孔板中并進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為24、48、72和96 h，再將10 μL的CCK- 8溶液加入每孔中，并放在培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行孵育，孵育時間為2 h，最后使用酶標(biāo)儀在刻度450 nm處進(jìn)行OD值的測定。

1.2.4體外遷移實驗 Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板購自于Costar公司，將細(xì)胞以5×104細(xì)胞/孔懸浮于0.5 mL的無血清DMEM培養(yǎng)液中接種內(nèi)槽，外槽加入含0.5 mL的體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液中，放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～36 h，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2，清洗PBS，對結(jié)晶紫進(jìn)行染色并清洗，鏡檢。隨機(jī)選取3個視野，計數(shù)遷移到每張膜下的細(xì)胞并重復(fù)3次。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測乳腺癌細(xì)胞凋亡 取轉(zhuǎn)染的各組細(xì)胞，將培養(yǎng)液去除后清洗3遍PBS，將100 μL細(xì)胞懸液加入5 mL離心管，再加入5 μL PI及5 μL FITC Annexin V進(jìn)行混勻，放置室內(nèi)避光處靜置15 min后再加入400 μL 1× Binding Buffer并進(jìn)行混勻，再放置室內(nèi)避光處反應(yīng)15 min，并采用流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，各組的差異比較采用獨立樣本t檢驗，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，患者生存率比較采用Log-rank檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hsa_circ_0026344在乳腺癌中呈低表達(dá)本研究對比hsa_circ_0026344在正常乳腺細(xì)胞MCF-10A及不同乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示hsa_circ_0026344正常乳腺細(xì)胞MCF-10A的表達(dá)水平與乳腺癌細(xì)胞株中的相對表達(dá)水平比較有明顯降低，其中T47D和MDA-MB-231降低表現(xiàn)尤為明顯(P<0.05，圖1A)。

2.2 hsa_circ_0026344表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后關(guān)系分析本研究進(jìn)一步檢測hsa_circ_0026344在癌旁正常組織與乳腺癌組織中的表達(dá)水平，qRT-PCR結(jié)果顯示乳腺癌組織中hsa_circ_0026344表達(dá)水平明顯低于正常乳腺組織(P<0.01，圖1B)。生存率分析顯示，hsa_circ_0026344低表達(dá)與乳腺癌患者的預(yù)后不良呈明顯相關(guān)(P<0.001，圖1C)。

A為采用qRT-PCR檢測hsa_circ_0026344在乳腺癌細(xì)胞株中的相對表達(dá)；B為hsa_circ_0026344在18對乳腺癌組織及癌旁非癌組織中的相對表達(dá)；C為Kaplan-Meier分析18例乳腺癌患者h(yuǎn)sa_circ_0026344高、低表達(dá)的總生存曲線；*P<0.05，**P<0.01。圖1 hsa_circ_0026344在乳腺癌中的表達(dá)

2.3 hsa_circ_0026344過表達(dá)抑制乳腺癌進(jìn)展本研究構(gòu)建hsa_circ_0026344過表達(dá)慢病毒載體，分別轉(zhuǎn)染T47D與MDA-MB-231細(xì)胞。qRT-PCR檢測hsa_circ_0026344在T47D與MDA-MB-231細(xì)胞中表達(dá)結(jié)果顯示，過表達(dá)組中的hsa_circ_0026344表達(dá)水平與對照組相比明顯升高(P<0.01，圖2A)。采用CCK-8法檢測hsa_circ_0026344過表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示，過表達(dá)組中的hsa_circ_0026344細(xì)胞增殖率與對照組相比明顯降低(P<0.05，圖2B)。流式細(xì)胞儀分析顯示hsa_circ_0026344的過表達(dá)能夠增加乳腺癌細(xì)胞的凋亡率(P<0.01，圖2C)。Transwell 遷移實驗檢測結(jié)果顯示，與基礎(chǔ)對照組相比，過表達(dá)組hsa_circ_0026344能夠使乳腺癌細(xì)胞穿膜數(shù)減少，侵襲能力明顯降低(P<0.01，圖2D)。

A為MDA-MB-231和T47D細(xì)胞在經(jīng)過hsa_circ_0026344過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后，hsa_circ_0026344表達(dá)明顯升高；B為CCK-8檢測顯示，hsa_circ_0026344過表達(dá)抑制了乳腺癌細(xì)胞的增殖；C為hsa_circ_0026344過表達(dá)能夠促使乳腺癌細(xì)胞凋亡；D為Transwell實驗表明，hsa_circ_0026344過表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞入侵減少；*P< 0.05，**P<0.01。圖2 hsa_circ_0026344過表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞增殖與遷移并促進(jìn)細(xì)胞凋亡

3 討論

circRNA是一類共價閉合的內(nèi)源性非編碼RNA，circRNA在眾多哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)，通過高通量測序技術(shù)，目前已在人體組織中發(fā)現(xiàn)超過百萬種circRNA。circRNA與傳統(tǒng)線性 RNA不同，雖然仍受核酸內(nèi)切酶的影響，但其對核酸外切酶介導(dǎo)降解存在抗性，其細(xì)胞中線性轉(zhuǎn)錄本更穩(wěn)定[8]，circRNA 主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，可參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄過程，且演化擁有較強(qiáng)的保守性[9]，提示circRNA在一些基本的生命過程中具有非常重要的作用[10]。circRNA的這些特性不僅是其在疾病生理過程中發(fā)揮作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，也暗示其作為疾病預(yù)測和診斷的新型標(biāo)志物，可能發(fā)揮重要的轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。

近年來，隨著生物信息技術(shù)的不斷發(fā)展與RNA-seq技術(shù)的應(yīng)用，circRNA以其特異性及較好的穩(wěn)定性已成為腫瘤領(lǐng)域靶標(biāo)研究熱點之一。研究顯示，circRNA在多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用[11]，如乳腺癌、肝癌、腸癌、胃癌等[12-15]。隨著高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，在乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)circRNA，且circRNA的表達(dá)存在明顯差異，在正常乳腺組織中檢測到的circRNA數(shù)量高于乳腺腫瘤組織。越來越多的證據(jù)表明，部分circRNA作為miRNA海綿功能參與調(diào)控腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。Memczak等[16]研究發(fā)現(xiàn)一些circRNA可以作為天然的miRNA海綿，可以結(jié)合miRNA并抑制其活性，對于調(diào)控miRNA靶標(biāo)發(fā)揮作用。有研究通過circRNA芯片篩選出乳腺癌組織中差異表達(dá)的circRNA，發(fā)現(xiàn)circ-ACBC10在乳腺癌組織中的表達(dá)上調(diào)，沉默circ-ACBC10 可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡[17-18]。通過生物信息學(xué)預(yù)測與熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實，circ-ACBC10與miRNA-1271靶向結(jié)合，且circ-ACBC10作為miRNA-1271海綿影響乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為[19]。總之，既往研究提示circRNA作為miRNA的海綿在乳腺癌發(fā)生、進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，hsa_circ_0026344在乳腺癌癌組織中的低表達(dá)水平之后，通過慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系構(gòu)建過表達(dá)hsa_circ_0026344的MDA-MB-231和T47D細(xì)胞。采用Transwell 侵襲實驗及CCK-8分別檢測hsa_circ_0026344過表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響，結(jié)果表明，hsa_circ_0026344過表達(dá)檢測后 MDA-MB-231與T47D的細(xì)胞增殖率均明顯降低。同時，hsa_circ_0026344進(jìn)行過表達(dá)檢測后，MDA-MB-231與T47D細(xì)胞的凋亡率顯著升高。該實驗結(jié)果表明hsa_circ_0026344過表達(dá)可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞增殖與遷移，促進(jìn)乳腺癌癌細(xì)胞凋亡。近期一項研究表明，hsa_circ_0026344在結(jié)腸癌中的表達(dá)較正常組織下降5倍[19]，該結(jié)果與本研究結(jié)果相符合。

綜上所述，hsa_circ_0026344在乳腺癌細(xì)胞及組織中表達(dá)降低，并與不良預(yù)后有關(guān)，hsa_circ_0026344的表達(dá)與細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。hsa_circ_0026344在體外的調(diào)控表明其可能是一種潛在的靶向治療乳腺癌的方法。