湯學超王飛宇張志鋼秦永文

(1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第960 醫(yī)院泰安院區(qū)心血管內科,山東 泰安 271000； 2.空軍杭州特勤療養(yǎng)中心療養(yǎng)二區(qū),杭州 310007； 3.上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院心血管內科,上海 200062； 4.上海長海醫(yī)院心血管內科,上海 200433)

自2001 年首個左心耳專用封堵器PLAATO 完成動物實驗并應用于人體后, 國外先后有WATCHMAN 封堵器、ACP 封堵器、Occlutech 等封堵器完成動物實驗,其中ACP 封堵器及WATCHMAN封堵器先后獲得歐洲CE 及美國FDA 雙認證,并均較為廣泛的用于臨床,且越來越多的學者認為對于存在抗凝禁忌的非瓣膜性患者,應用WATCHMAN左心耳封堵器進行左心耳封堵甚至可以成為預防栓塞并發(fā)癥的一線方案[1-2]。 國內也有LAmbre(深圳先健)封堵器和Lefort 封堵器完成動物實驗及臨床實驗,其中LAmbre 已經于2017 年通過中國CFDA 的審核,開始在國內銷售應用[3-4]。 如果按照封堵器結構類型分類,左心耳封堵器可以分為一體化的封堵器(如WATCHMAN 封堵器及Occlutech 封堵器等)及分體型的左心耳封堵器(如ACP 封堵器及LAmbre 封堵器等)。 目前國內外還有許多機構及公司正在研發(fā)左心耳封堵器,其結構類型無非也是上述的兩種結構[5]。 長海醫(yī)院心內科自2004 年就開始了左心耳封堵器的研發(fā),歷經單盤草帽、雙盤分體等不同形態(tài),最終與上海普實醫(yī)療器械科技有限公司共同研發(fā)出兩種新型左心耳封堵器,分別為雙盤分體型左心耳封堵器及單盤圓柱型左心耳封堵器。 為進一步探討兩種不同封堵器的安全性及有效性,為下一步封堵器的研發(fā)提供參考,特進行動物實驗研究。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康普通級比格實驗犬14 只,其中雄性8 只,雌性3 只,月齡15 ～22 月,體重9 ～12 kg,平均(10.32±0.95)kg,由上海甲干生物科技有限公司[SCXK(滬)2015-0005]提供,實驗完成后過渡室觀察3 d 后送回公司,室溫下標準飼養(yǎng)[SYXK(滬)2019-0002]。 該研究經海軍軍醫(yī)大學動物管理委員會批準實驗。 實驗動物處置均符合國家科委2011 年修訂的《實驗動物管理條例》,并遵循“減少、替代和優(yōu)化”3R 原則給予人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

速眠新Ⅱ注射液(吉林敦化圣達動物藥品有限公司生產)；1%丙泊酚注射液(意大利阿斯利康公司生產)；依諾肝素鈉注射液(法國賽諾菲公司生產)；雙盤分體型左心耳封堵器(上海普實醫(yī)療器械有限公司)；單盤圓柱型左心耳封堵器(上海普實醫(yī)療器械有限公司)；左心耳輸送系統(tǒng)(上海普實醫(yī)療器械有限公司)等。 本實驗其它藥品及器材均為實驗室及導管室常規(guī)器材。

雙盤分體型封堵器由鎳鈦合金網編織的固定盤及覆蓋盤組成,中間由一個不銹鋼環(huán)連接,心房側有一個連接鉚可用于與輸送鋼絲連接。 固定盤高度為5 mm,封堵器整體高度為8 mm。 固定盤周圍有6～8 個一體化雕刻J 型微刺,內覆2 層無紡聚酯纖維；覆蓋盤的直徑較固定盤直徑大于2 mm,盤面內凹,內覆無紡聚酯纖維膜(圖1)。 以固定盤直徑命名封堵器規(guī)格,設置了16 mm、18 mm、20 mm三種規(guī)格。

單盤圓柱型左心耳封堵器的高度為6 mm,靠近心房側的盤面直徑大于心耳側盤面直徑2 mm,盤內縫合兩層無紡聚酯纖維膜,封堵器周圍有6 ～8 個一體化雕刻形成的微刺,心房側及有一個連接鉚(圖2)。 以靠近心房側的盤片直徑命名封堵器規(guī)格,設置了16 mm、18 mm 及20 mm 三種規(guī)格。

1.3 實驗方法

1.3.1 術前一般處理及麻醉

實驗犬實驗前12 h 禁食水。 術前使用速眠新Ⅱ0.05 mL/kg+阿托品0.02 mg/kg 肌肉注射誘導麻醉,待動物麻醉后將實驗犬固定在DSA 床上,前胸及雙側腹股溝區(qū)去毛后,常規(guī)消毒鋪無菌洞巾,穿刺股動脈后給予1%丙泊酚注射液1 mg/kg?20 min 維持麻醉。

1.3.2 左心耳封堵術

圖1 雙盤分體型左心耳封堵器(18 mm 規(guī)格)Figure 1 Left atrial appendage occluder with double-disc(size 18 mm)

圖2 單盤圓柱型左心耳封堵器(16 mm 規(guī)格)Figure 2 Left atrial appendage occluder with singe disc cylinder(size 16 mm)

圖3 雙盤分體型左心耳封堵器封堵左心耳Figure 3 LAAC with double-disc occluder

實驗犬全身麻醉后平躺固定在DSA 手術床上,術中給予持續(xù)心電監(jiān)護。 穿刺右側股靜脈及左側股動脈,分別置入6 F 防漏血管鞘。 經股動脈鞘管連接有創(chuàng)動脈壓持續(xù)監(jiān)測血壓。 房間隔穿刺成功后,給予普通肝素100 IU/kg 全身肝素化,然后經內鞘送入兩圈半左房鋼絲至左房。 沿左房鋼絲將Swartz 鞘送入左房后保留左房鋼絲,退出房間隔穿刺鞘。 沿左房鋼絲送入10 F 左心耳輸送鞘管,退出內鞘。 沿左房鋼絲將6 F 豬尾導管送至左心耳,退出左房鋼絲。 在RAO25o+CAU15o投影角度下行左心耳造影,確定左心耳形態(tài)及外口內徑、著陸區(qū)內徑。 逆時針旋轉豬尾導管并沿豬尾導管將輸送鞘管送至左心耳頸部。 根據(jù)體外測試結果,和實驗犬左心耳相對較小的情況,選擇比開口最大內徑或著陸區(qū)最大內徑+2 mm 規(guī)格的封堵器,使用裝載器充分排氣后將其送入輸送鞘管。

(1)雙盤分體型封堵器的釋放方法

將封堵器送至輸送鞘管頭端,固定推送桿,緩慢回撤輸送鞘,使封堵器固定盤釋放約1/2。 整體前送推送桿、輸送鞘及部分釋放的固定盤使固定盤送至左心耳頸部或更深處,調整位置合適后繼續(xù)回撤輸送鞘,使固定盤完全釋放并固定在左心耳著陸區(qū)；繼續(xù)回撤輸送鞘使覆蓋盤釋放并將左心耳口部覆蓋；牽拉實驗證實封堵器位置是否固定牢靠；復查造影顯示左心耳是否存在殘余分流。 確定封堵器位置合適、無殘余分流后,釋放封堵器(圖3)。(2)單盤圓柱型封堵器的釋放方法

將封堵器送至輸送鞘管前端,固定推送桿,緩慢回撤輸送鞘,使封堵器釋放約1/2。 整體前送推送桿、輸送鞘及部分釋放的封堵器送至左心耳頸部或更深處,調整位置合適后繼續(xù)回撤輸送鞘,使封堵器完全釋放并固定在左心耳著陸區(qū)。 牽拉實驗證實封堵器位置是否固定牢靠；復查造影顯示左心耳是否存在殘余分流。 確定封堵器位置合適、無殘余分流后,釋放封堵器(圖4)。

1.3.3 術后動物處理

封堵器釋放后監(jiān)測生命體征15 min,生命體征穩(wěn)定后退出鞘管。 術后右側股靜脈穿刺部位8 字縫合包扎,左側股動脈穿刺結扎止血。 實驗犬靜脈穿刺成功后給予青霉素鈉G80 萬單位靜脈注射。 術后2～3 d 給予低分子肝素1000 IU/12 h 皮下注射,青霉素G80 萬單位/12 h 肌肉注射；阿司匹林腸溶片5 mg/kg 口服直至動物處死。 術后實驗犬于實驗室觀察飼養(yǎng)3 d,觀察精神狀態(tài)、進食、行為及活動能力、大小便情況,實驗犬恢復至術前狀態(tài)后集中飼養(yǎng)。

1.3.4 大體標本檢查

非預期死亡的實驗犬立即進行大體標本檢查,重點觀察有無心包積液、封堵器表面血栓情況及封堵器對左上肺靜脈及二尖瓣環(huán)的影響；存活的試驗犬術后分別于第45 天、80 天、110 天、15 月分別處死實驗犬,將左心房剖開觀察封堵器表面組織覆蓋情況及封堵器與二尖瓣環(huán)、左上肺靜脈的關系。

1.3.5 組織病理學檢查

封堵器表面組織行HE 染色及DAPI、CD31 免疫熒光檢查評價內皮化程度。 HE 染色及熒光染色依托武漢賽維爾生物科技有限公司進行處理。 普通組織病理學檢查常規(guī)經過取材固定、脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、蘇木素染細胞核、伊紅染細胞質、脫水封片、顯微鏡鏡檢、圖像采集分析過程。

2 結果

2.1 實驗犬左心耳封堵術情況

6 只實驗犬使用單盤圓柱型封堵器,其中2 只實驗犬使用16 mm 規(guī)格封堵器,3 只實驗犬使用18 mm 規(guī)格封堵器,1 只實驗犬使用20 mm 規(guī)格封堵器。 所有封堵器植入后左房造影均顯示造影劑可充盈至阻隔膜處,但無殘余分流至左心耳。

8 只實驗犬使用雙盤分體型封堵器進行左心耳封堵,其中使用16 mm 及18 mm 規(guī)格分別為5 只及3 只；術中除1 例實驗犬經左房造影證實存在少量殘余分流外,其余7 例均無明顯殘余分流。 1 條實驗犬于術后9 h 死亡,另外1 條實驗犬術后36 h 死亡,其余6 條實驗犬存活至隨訪期結束。

2.2 大體標本檢查情況

使用單盤圓柱型封堵器進行的左心耳封堵的6條實驗犬,5 條實驗犬于術后30 min～8 h 死亡；1 條實驗犬存活至15 月后處死。 通過對死亡實驗犬進行解剖,5 條實驗犬術后均未發(fā)現(xiàn)心包積液,排除心包填塞導致的死亡。 1 例實驗犬術后30 min 死亡,解剖發(fā)現(xiàn)左上肺靜脈可見腫脹、充血,封堵器完全封堵左心耳,表面無血栓,盤面邊緣與二尖瓣環(huán)相距3 mm,與肺靜脈開口相距4 mm。 死亡原因考慮封堵器壓迫肺靜脈導致急性肺水腫。 其余4 條實驗犬封堵器表面均存在大量血栓(圖5)。 存活的1 條實驗犬15 月后處死,未見心包積液及心包粘連,左房內觀察封堵器表面只見薄層半透明新生組織,且大約1/5 的表面未見新生組織覆蓋(圖6)。 使用雙盤分體型進行封堵的8 例實驗犬,1 例術后約20 min 后透視發(fā)現(xiàn)封堵器移位,雖然實驗犬30 min 蘇醒,但術后9 h 實驗犬死亡。 尸檢發(fā)現(xiàn)封堵器平躺在左心耳內,心耳內及封堵器周圍可見血栓形成,并與封堵器粘連在一起；還有1 例術后36 h 突發(fā)股動脈穿刺部位血腫死亡。 其余6 例實驗犬均存活至隨訪結束,隨訪時間為1～15 月。

分別在術后45 d、80 d、110 d 及15 月處死實驗犬,打開胸腔后觀察心包,均未發(fā)現(xiàn)心包積液；剖開左心室及左心房,暴露覆蓋盤,見覆蓋盤未影響二尖瓣及左上肺靜脈,覆蓋盤表面光滑,無血栓附著。術后第45 天表面組織為半透明組織,封堵器周圍可見肉芽組織形成；術后80 d 覆蓋盤表面可見半透明新生組織,但是未能將連接鉚覆蓋,周邊與心房壁接觸部位存在一定的摩擦與潰瘍,也有少量肉芽組織形成；術后110 d、及15 月覆蓋盤表面新生組織明顯增厚,連接鉚亦被一層薄組織覆蓋(圖7)。

2.3 組織病理學及免疫熒光檢查

圖4 單盤圓柱型左心耳封堵器封堵左心耳(16 mm)Figure 4 LAAC with singe disc occluder

圖5 應用單盤圓柱型左心耳封堵器之死亡犬Note.Clots formation on the surface of single disc occluder.Figure 5 Unexpected died canines with single disc occluder for LAAC

圖6 應用單盤圓柱型左心耳封堵器之存活犬Note.One fifth of disc was not covered by new born tissue post LAAC with singe disc occluder.Figure 6 Survived canine with single disc occluder for LAAC

術后110 d 封堵器表面組織HE 染色,見細胞排列按照內皮、內皮下層及內膜下層排列,并可見許多新生血管形成,覆蓋盤表面組織形成完整的內膜結構。 新生組織無明顯炎癥等異物反應。 DAPI(Blue)及CD31(Red)免疫熒光染色,術后45 d、80 d 可見DAPI 及CD31 陽性的新生內皮細胞；術后110 dDAPI 及CD31 陽性細胞數(shù)目明顯增加(圖8)。

3 討論

本實驗分別對自主設計的兩種不同結構的左心耳封堵器進行了安全性的評價,并對封堵系統(tǒng)的可操作性進行了評估。 研究結果顯示這種單盤圓柱型封堵器結構不合理,需要進一步改進；而雙盤分體型封堵器生物相容性好,安全性高。

圖7 應用雙盤分體型左心耳封堵器之存活犬Note.A, Semitransparent tissue formatted on the surface of occluder and granulation tissue formatted around the occluder 45 days post procedure.B, The semitransparent new tissue on the surface of disc failed to cover the connection, there was ulcer around the contact part with atrial wall and a small amount of granulation tissue formatted 80 days post procedure.C/D,The new born tissue covered the sealing disc and connection completely 110 days post procedure.Figure 7 Survived canines with double-disc occluder for LAAC

動物實驗早期,我們多采用單盤圓柱型封堵器進行實驗犬左心耳封堵,令人遺憾的是,使用單盤圓柱型封堵器進行的左心耳封堵的6 例實驗犬,5例均在術后8 h 內死亡。 通過對死亡實驗犬進行心臟解剖,發(fā)現(xiàn)1 條實驗犬因為選擇了偏大的封堵器,導致對封堵器的左上肺靜脈的壓迫、急性左心衰竭死亡；其余4 例實驗犬的封堵器表面存在大量血栓,而在解剖心臟過程中均未發(fā)現(xiàn)明顯心包積液,考慮血栓栓塞導致死亡的可能性較大。 另外,存活的1條實驗犬即使在術后15 月進行處死,仍然發(fā)現(xiàn)內皮化不完整。

圖8 不同時期免疫熒光染色Note.A, HE and Immunofluorescence staining confirmed DAPI and CD31 positive cells 45 days post procedure.B, DAPI and CD31 positive cells increased 80 days post procedure.C, Neovascularization formatted 110 days post procedure.(CD31 positive in red fluorescence and DAPI positive in blue fluorescence).Figure 8 Immunofluorescence staining in different periods

單盤圓柱型封堵器及目前臨床應用較為廣泛WATCHMAN 封堵器同為一體化設計的左心耳封堵器,但是它術后急性血栓發(fā)生率如此高,內皮化緩慢,考慮與其結構缺陷有關。 本單盤圓柱型封堵器為鎳鈦合金編織的圓柱狀,其聚酯纖維阻隔膜內置,當植入左心耳內時編織網與阻隔膜之間存在一定的間隙,血流存在于這個間隙內,因此容易造成血栓形成；而使用聚四氟乙烯外覆的WATCHMAN封堵器,其表面為光滑的阻隔膜直接面對血流,因此不易形成血栓。 因此,從單盤圓柱型封堵器的動物實驗,我們得到的經驗教訓是,對于一體化的左心耳封堵器,不管采取何種阻隔膜、何種形態(tài),其面向心房側的結構需采取緊密結合的方式,阻隔膜與編織網內不能存在間隙,這樣可能會減少血栓的形成,加快內皮化。

采用雙盤分體型左心耳封堵器進行動物實驗,結果則令人欣慰。 8 例實驗犬均成功進行了左心耳封堵,雖然發(fā)生2 例非預期死亡,但是根據(jù)尸檢結果考慮封堵器移位及股動脈血腫,均為操作相關死亡。 其余6 例使用雙盤分體型封堵器進行左心耳封堵的實驗犬未再發(fā)生非預期的死亡。 對術后存活的實驗犬定期處死后,觀察封堵器的微刺對左心耳壁損傷均較小,未發(fā)現(xiàn)心包積液、心臟穿孔及肺動脈穿孔的情況。

應用雙盤分體型封堵術后第45 天及第80 天覆蓋盤表面就有光滑的新生組織形成,但是未能將覆蓋盤的連接鉚完全覆蓋；術后110 d 封堵器覆蓋盤表面新生組織完全覆蓋連接鉚。 對術后110 d 的覆蓋盤表面新生組織進行HE 染色、免疫熒光檢查,證實新生組織為完整的內膜,包括內皮、內皮下層及內膜下層。 這種完全及完整內膜化既可以達到隔離心耳血栓的作用,而且還可以避免覆蓋盤盤面血栓形成,理論上在內膜化完成后可無需使用抗栓藥物預防器械相關血栓形成。 覆蓋盤完全完整內膜化得益于這種緊密內覆式覆蓋盤的處理,這為我們以后進行左心耳封堵器的研發(fā)中具有一定的意義。從對不同時間段封堵器表面內皮化及封堵器與周圍組織的炎癥及排異現(xiàn)象進行分析,我們認為雙盤分體型封堵器的生物相容性好,植入體內安全。

由于實驗犬的數(shù)量有限,因此未能對封堵術后覆蓋盤面的內膜化過程進行詳細的跟蹤,但是曾經有學者作了相關的研究并進行了詳細的闡述。Schwartz 等[6]觀察了9 條實驗犬及4 例人體WATCHMAN 封堵器植入左心耳后組織愈合過程,通過對實驗犬植入封堵器3 d、45 d、90 d 三個不同時間段及人左心耳封堵器植入139 d、200 d、480 d、852 d 后非器械相關死亡后心臟組織檢查分析認為：1.封堵器表面組織覆蓋遵循以下過程,首先富含纖維蛋白的血栓形成,繼而發(fā)生含有巨噬細胞及淋巴細胞的肉芽腫炎癥反應使血栓機化,然后在蛋白多糖-膠原纖維基質中形成由平滑肌細胞組成的血管翳,表面內皮化進程伴隨有持續(xù)血栓吸收,最后類似于心內膜的內膜化完成；2.這種組織愈合與冠脈支架植入后內皮形成、ASD、PFO 等封堵器植入后的內皮修復一致；3.實驗犬可以在45 天內完成,但人體的修復要比實驗犬的修復慢。 根據(jù)Schwartz等[6]的研究結果,可以推斷封堵器表面的內膜化時間可能與封堵器的覆蓋盤面積大小關系不大,而與連接鉚的長度相關。 張志鋼等[7]、儲國俊等[8]曾對雙盤狀封堵器先后進行動物實驗,證實覆蓋盤能在1 月形成一層透明的內皮,3 月內皮明顯增厚,但是它們的連接鉚均較長,連接鉚較難完全內皮化；第一代ACP 左心耳封堵器同樣存在連接鉚較長的問題,因此器械表面血栓發(fā)生率較高[9]。

雙盤分體型左心耳封堵器特殊的設計理念使得該封堵器既可以實現(xiàn)蓋口封堵,也可以實現(xiàn)堵口封堵,因為覆蓋盤的內凹鈍化,使得即使封堵器拽向心耳頸部,其盤片邊緣對心耳壁的切割作用也被內凹的盤片所化解。 雖然雙盤分體型既可以堵口,也可以封口,但是何種封堵方式有力于內皮化,對周圍結構影響較小,封堵方式對臨床預后又有什么區(qū)別,目前尚無頭對頭對照研究,只有少數(shù)學者對WATCHMAN 及ACP 封堵器所發(fā)表的數(shù)據(jù)進行薈萃分析及文獻分析,結果顯示兩者安全性及有效性相似,但是需要進一步的動物實驗研究及臨床對照研究[10-12]。 從雙盤分體型封堵器的動物實驗結果發(fā)現(xiàn),只有1 條實驗犬實行的是蓋口封堵,80 d 后解剖雖然未發(fā)現(xiàn)明顯的血栓,但是覆蓋盤與心房組織并未能融合,心房壁被磨損的痕跡明顯,因此這些地方可能比較容易形成血栓。 此外張志鋼等[7]的研究也存在蓋口封堵時心房壁被磨損的痕跡。 而雙盤分體型動物實驗的其余6 條實驗犬植入的封堵器覆蓋盤盤面均為堵塞心耳頸部,術后不同時間段均發(fā)現(xiàn)其與周圍組織結構融合較好。 我們的動物實驗也證實了這種情況,因此從這些結果分析,雙盤分體型封堵器堵口封堵策略可能利于覆蓋盤與周圍組織的融合,減少封堵器表面血栓形成,但需要更多的動物實驗及臨床實驗來驗證。

存活的實驗犬封堵術后短期使用低分子肝素抗凝,然后使用阿司匹林單聯(lián)抗血小板聚集治療,隨訪中未發(fā)現(xiàn)血栓事件發(fā)生。 圍術期的這種抗栓策略,在以后進一步的臨床應用中具有一定的參考價值,為應用雙盤分體型進行LAAC 術后的預防血栓方案提供了動物實驗依據(jù)。

在應用雙盤分體型封堵器進行左心耳封堵的動物實驗過程中,即使在無食道超聲引導下,都可以取得很好的封堵效果,即時手術成功率高,同時還不會影響二尖瓣及左上肺靜脈。 因此雙盤分體型封堵器封堵實驗犬的左心耳,操作容易,成功封堵率高；對不同時間段封堵器表面組織新生組織的檢查,認為完全完整內膜化可在4 月內完成,生物相容性好。 因此雙盤分體型封堵器封堵左心耳可行,有希望在臨床進一步應用。 而單盤圓柱型左心耳封堵器由于存在設計的缺陷,圍術期試驗犬死亡率高,因此需要進一步的改進,不適合在臨床應用。

本實驗的主要不足：實驗動物偏少,所選實驗犬偏小,實驗犬左心耳的大小相近,只使用了16 mm～20 mm 規(guī)格的封堵器,缺乏較大規(guī)格封堵器的可行性及封堵效果的評價,以及完全內膜化時間的評價；本研究使用的實驗犬均為健康實驗犬,其心臟結構及心房、左心耳大小及左心耳壁的厚度與房顫犬存在一定的差異。