楊曉旭，趙振宇

天津醫(yī)科大學(xué)朱憲彝紀(jì)念醫(yī)院，天津300400

有研究發(fā)現(xiàn)，2 型糖尿病對神經(jīng)性疾病、心血管疾病、視力障礙、腦卒中、腎病等代謝并發(fā)癥的潛在影響較大［1-3］。利拉魯肽作為臨床常用的腸促胰島素激素，與人體內(nèi)源性?；雀哐撬貥与?（GLP-1）氨基酸序列高度相似，具有天然GLP-1 的功效和代謝穩(wěn)定性，可有效降低患者的血糖水平，單獨(dú)應(yīng)用或與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用，降血糖效果均較好［4］。但因個(gè)體基因有差異，2 型糖尿病的疾病進(jìn)展也不相同，對同種治療藥物的反應(yīng)也有差異［5］。有學(xué)者分析了全基因、候選基因組發(fā)現(xiàn)對2 型糖尿病提供貢獻(xiàn)作用的遺傳變異相關(guān)位點(diǎn)有近100 個(gè)［6］。內(nèi)源性大麻素受體1 型（CNR1）基因位于人類染色體6Q14～Q15，全基因共有外顯子8 個(gè)，在不同群體中表達(dá)均有差異，可影響大麻素類物質(zhì)功能及其代謝［7］。有研究發(fā)現(xiàn)，CNR1 基因 rs1049353 位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性與2 型糖尿病藥物療效有關(guān)［8］?，F(xiàn)階段，對于CNR1 基因rs1049353 位點(diǎn)多態(tài)性與利拉魯肽治療早期2 型糖尿病療效的關(guān)系研究較少，故本研究對此進(jìn)行了探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇本院2018 年2 月—2020 年2月收治的早期2 型糖尿病患者241 例，男133 例、女108 例，年齡（46.54 ± 8.03）歲，病程（1.21 ± 0.24）年。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《中國2 型糖尿病防治指南（2017 年版）》［9］中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；②BMI 為 23.0～32.0 kg/m2；③病程≤2 年，接受利拉魯肽治療，且二甲雙胍單用或使用其他藥物口服或皮下注射治療血糖控制較差；④餐后2 h 血糖（2 h PG）≥11.1 mmol/L或空腹血糖（FPG）≥7.0 mmol/L，糖化血紅蛋白（HbA1c）≥6.5%［9］。排除標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)臨床診斷為其他類型糖尿病、肝腎疾??；②既往接受GLP-1類藥物治療；③存在腦卒中、心肌梗死等心腦血管疾病；④治療時(shí)還采用其他降血糖類藥物治療；⑤伴惡性腫瘤?；颊呔炇鹬橥鈺１狙芯恳勋@得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 治療方法 患者均給予利拉魯肽［諾和諾德制藥有限公司（中國），規(guī)格∶3 mL∶18 mg］皮下注射，以0.6 mg/d 為初始劑量，隨后劑量逐漸加至1.2 mg/d，可根據(jù)患者的耐受情況、血糖水平調(diào)整，但最大劑量<1.8 mg/d。連續(xù)治療4個(gè)月。

1.3 BMI計(jì)算及2 h PG、HbA1c、FPG檢測 測量患者體質(zhì)量及身高，計(jì)算BMI，BMI=體質(zhì)量/身高2。于治療前后抽取患者靜脈血2 mL，用低壓液相色譜法測定HbA1c，用己糖激酶法測定FPG、2 h PG。

1.4 CNR1 基因多態(tài)性檢測 于治療前抽取患者外周靜脈血5 mL，從全血中提取基因組DNA，采用Chelex-100 法從全血中提取基因組DNA，將所提取的DNA 置于冰箱（-20 ℃）中保存，并用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增，設(shè)計(jì)上下游PCR 引物，位點(diǎn)為1260G>A，即rs1049353，擴(kuò)增該位點(diǎn)及附近的DNA 片段，擴(kuò)增條件：95 ℃初始變性6 min，94 ℃變性30 s 共35個(gè)循環(huán)，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，72 ℃再延伸7 min。 1260G>A 位點(diǎn)上游引物序列5'-GAAAGCTGCATCAAGAGCCC-3'，下游引物序列5'-TTTTCCTGTGCTGCCAGGG-3'。在37 ℃用MSPⅠ限制性核酸內(nèi)切酶5U（德國圣萊昂羅特酵素股份有限公司）過度消化PCR 產(chǎn)物10 μL，用2%瓊脂糖凝膠電泳分離消化，將A等位基因切割，片段92、19 bp；G等位基因未切割，片段111 bp。

1.5 外周血單核細(xì)胞（PBMC）內(nèi)CNR1 mRNA 表達(dá)檢測 治療前收集患者新鮮外周血標(biāo)本164 例。對所得樣本用淋巴細(xì)胞分離液Histopaque-1077 提取PBMC，采用 TRIzol 試劑提取 PBMC 中的 RNA，用美國RT-PCR 儀進(jìn)行檢測。擴(kuò)增條件：95 ℃初始變性10 min，95 ℃變性30 s，共35 個(gè)循環(huán)，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，72 ℃再延伸7 min。CNR1-1260G>A 上游引物序列 5'-TTCACAGGGCCGCAGAAAG-3'，下游引物序列5'-GAGGCATCAGGCTCACAGAG-3'。探針序列：突變型5'-VIC-ATCAAGAGCACAGTCAA?GATTGCC-TAMRA-3'，野生型 5'-Fam-ATCAAGAG?CACGGTCAAGATTGCC-TAMRA-3'。用 2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用±s表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CNR1 基因 rs1049353 位點(diǎn)的分型 241 例患者 rs1049353 位點(diǎn)的分型：GA 型 46 例，占 19.09%；AA 型 5 例，占 2.07%；GG 型 190 例，占 78.84%。等位基因頻率最小為0.107，均符合哈迪溫伯格平衡（P>0.05）。因 AA 型例數(shù)少，將 AA 型與 GA 型患者合并用于后期分析。GA 型/AA 型患者男33 例、女18 例，年齡（46.71 ± 8.94）歲；GG 型患者男 100 例、女90 例，年齡（46.50 ± 7.83）歲。兩種類型患者性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）。

2.2 241 例患者治療前后BMI、2 h PG、HbA1c、FPG比較 241 例患者治療后BMI、2 h PG、HbA1c、FPG均較治療前降低（P<0.05），見表1。

2.3 不同基因型患者治療前后BMI、2 h PG、HbA1c、FPG 比較 治療前不同基因型患者BMI、2 h PG、HbA1c、FPG 比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）；治療后 GA 型/AA 型、GG 型 BMI、2 h PG、HbA1c、FPG 水平均較治療前降低（P均<0.05），GA型/AA 型患者 BMI、HbA1c、FPG 均較 GG 型患者低（P均<0.05），不同基因型患者2 h PG 水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表1 241例患者治療前后BMI、2 h PG、HbA1c、FPG比較（±s）

表1 241例患者治療前后BMI、2 h PG、HbA1c、FPG比較（±s）

時(shí)間治療前治療后t P BMI（kg/m2）25.91±1.64 22.67±1.58 22.087 0.000 2 h PG（mmol/L）14.93±1.82 8.71±1.56 40.282 0.000 FPG（mmol/L）11.69±1.66 6.36±1.55 36.433 0.000 HbA1c（%）9.54±0.96 6.86±0.82 33.003 0.000

表2 不同基因型患者BMI、2 h PG、HbA1c、FPG比較（-x± s）

2.4 不同基因型患者CNR1 mRNA 表達(dá)比較 164例患者提取 PBMC 合格樣本，其中 AA 型 1 例、GA 型30 例、GG 型133 例，且基因型分布頻率與哈迪溫伯格平衡相符（P>0.05）。GA 型/AA 型、GG 型患者PBMC 中CNR1mRNA 的相對表達(dá)量分別為2.13 ±0.87、4.98 ± 1.65，GG 型患者PBMC 中CNR1 mRNA的相對表達(dá)量高于GA 型/AA 型患者（t=7.711，P<0.05）。

2.5 不同基因型患者利拉魯肽不良反應(yīng)比較 不同基因型患者不良反應(yīng)發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表3。

表3 不同基因型患者利拉魯肽不良反應(yīng)比較［例（%）］

3 討論

2 型糖尿病是常見的內(nèi)分泌代謝疾病，具有較高的發(fā)病率［10］。臨床上常通過控制血糖指標(biāo)的方式對其進(jìn)行治療，從而改善胰島β細(xì)胞功能，刺激第一時(shí)相胰島素的分泌，以解除糖毒性的不良影響。利拉魯肽是GLP-1受體激動(dòng)劑，可促進(jìn)胰島素分泌，并抑制胰高血糖素分泌，阻止胰島β細(xì)胞的凋亡，有效控制血糖［11］?；蚨鄳B(tài)性對藥物療效有一定影響。CNR1 基因是介導(dǎo)大麻素發(fā)揮作用的重要分子，可參與機(jī)體多種生理和病理過程。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)小鼠CNR1 基因被敲除后，會(huì)降低血中瘦素、胰島素的水平，從而影響機(jī)體消耗血糖水平與能量；在CNR1基因的3'側(cè)翼區(qū)存在的AAT重復(fù)序列，可于DNA 內(nèi)部形成Z 型結(jié)構(gòu)，影響其轉(zhuǎn)錄功能及大麻素的正常功能［12］。CNR1 系統(tǒng)失調(diào)與多種代謝性疾病緊密聯(lián)系，其多態(tài)性位點(diǎn)rs1049353 參與著多種病理學(xué)疾病，如克羅恩病、冠狀動(dòng)脈疾病等［13］。CNR1 是 2 型糖尿病的重要關(guān)聯(lián)易感基因，研究CNR1 多態(tài)性并分析其對利拉魯肽治療早期2 型糖尿病療效的影響，探討其作用機(jī)制，具有重要臨床意義。

本研究結(jié)果顯示，GG 型在2 型糖尿病患者中占較高比例。趙倩等［14］研究表明，在納入的230 例早期 2 型糖尿病患者中，GG 型 188 例，占比為 81.7%，略高于本研究。分析其原因可能為所選取研究對象的地區(qū)差異、年齡差異等因素造成。本研究患者采用利拉魯肽治療后，BMI、2 h PG、FPG、HbA1c 均低于治療前，說明利拉魯肽可較好地控制機(jī)體血糖、BMI。分析其原因?yàn)槔旊淖鳛镚LP-1 受體激動(dòng)劑，可延緩胃排空，抑制食欲，在一定程度上降低了機(jī)體BMI，從而減輕肥胖。有研究表明，2 型糖尿病患者高血糖的出現(xiàn)是與胰島素分泌受損、胰島β 細(xì)胞功能障礙有關(guān)［15］。利拉魯肽以依賴葡萄糖濃度的方式，增強(qiáng)胰島素分泌，抑制胰高血糖素的分泌，還可最大程度解除糖毒性的影響，改善胰島素抵抗，延緩胰島β 細(xì)胞衰竭，從而降低患者血糖［16］。另有研究表明，利拉魯肽還可作用于磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2/c-jun氨基末端激酶1/2 信號通路，抑制β 細(xì)胞凋亡，改善血糖［17］。另治療后 GA 型/AA 型、GG 型BMI、2 h PG、HbA1c、FPG水平均較治療前降低，治療后GA型/AA型 BMI、HbA1c、FPG 水平均較 GG 型低，而不同基因型患者2 h PG水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能是CNR1基因中的1260G>A 位點(diǎn)可影響中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，從而直接或間接影響利拉魯肽治療早期2 型糖尿病的效果。因此臨床可根據(jù)患者基因型合理選擇治療藥物。

另本研究結(jié)果顯示，GG 型CNR1 mRNA 的相對表達(dá)量高于GA 型/AA 型。與野生型GG 型患者血糖、BMI 水平比較，GA 型/AA 型患者血糖、BMI 控制更佳，臨床療效更好。分析其原因?yàn)镃NR1 為內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)中的重要基因，可作用于外周、中樞系統(tǒng)，并調(diào)控腹側(cè)紋狀體、丘腦、海馬及邊緣系統(tǒng)的杏仁核，影響神經(jīng)系統(tǒng)，進(jìn)而影響食欲。GG 型為野生型，屬于顯性基因，相對于GA 型/AA 型這一突變型基因而言，于人體中存在的比例較高。CNR1 G等位基因高表達(dá)，會(huì)增加患者食欲，表現(xiàn)出糖尿病的多飲、多食等典型癥狀，因此GG 型CNR1mRNA 的相對表達(dá)量較高，影響療效。而A 等位基因攜帶者經(jīng)藥物治療后，胰島素抵抗明顯減輕，并可提高代謝值，體質(zhì)量減輕，從而對利拉魯肽治療早期2型糖尿病效果產(chǎn)生影響［18］。

本研究中不同基因型患者不良反應(yīng)發(fā)生率比較無差異，說明不良反應(yīng)不會(huì)受基因分型的影響，各型患者使用利拉魯肽均較為安全。目前，CNR1 基因多態(tài)性對早期2 型糖尿病的作用靶點(diǎn)、發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，后期仍需深入探討其作用機(jī)制。同時(shí)本研究也存在不足之處，如研究對象為單中心，群體代表性上存在一定局限性，對于環(huán)境背景、遺傳不同的人群研究不適用，后期將納入多中心、多種人群以做進(jìn)一步深入研究。