常玉廣，曹晶晶

(南京曉莊學院 環(huán)境科學學院，江蘇 南京 211171)

0 引言

木質(zhì)纖維素是價格低廉的可再生資源[1]，可作為生產(chǎn)生物絮凝劑的底物碳源，降低生物絮凝劑的生產(chǎn)成本，具有一定的可行性和開發(fā)潛力.

研究表明[2]，秸稈類纖維素經(jīng)過生物降解，部分葡萄糖等小分子物質(zhì)被釋放出來，成為可被絮凝菌利用的最適碳源.本實驗在前期研究的基礎上[3-5]，研究兩段式發(fā)酵工藝中的糖化過程，糖化過程中產(chǎn)生的還原糖被絮凝菌利用，生成生物絮凝劑.

1 實驗部分

1.1 實驗材料

纖維素菌HIT-3來源于土壤中，為木糖無色桿菌反硝化亞種(Achromobacterxylosoxidansdenitrificans)，該菌株具有較強的降解纖維素的能力；絮凝菌F2主要來源于含油廢水處理單元曝氣池中的水樣，芽孢桿菌屬(Bacillussp.)，兩例菌均為哈爾濱工業(yè)大學環(huán)境生物技術實驗室開發(fā)[6].

纖維素的原料：稻草(將稻草進行堿液浸泡、清洗、烘干、粉碎、過篩、滅菌)，用于兩段發(fā)酵工藝中的第一段纖維素高效糖化階段的底物碳源.

1.2 實驗方法

1.2.1 兩段式發(fā)酵工藝

圖1 兩段式發(fā)酵工藝流程

第一段發(fā)酵工藝(纖維素高效糖化)：以堿液處理過的稻草(20 g/L)為碳源，配制纖維素培養(yǎng)基，滅菌后裝入發(fā)酵罐中，并將高效纖維素降解菌群(HIT-3)種子發(fā)酵液投入發(fā)酵罐中，完成纖維素的高效糖化過程(生成糖化液)；第二段發(fā)酵工藝(糖化液制取生物絮凝劑)：將高效產(chǎn)絮菌(F2)種子發(fā)酵液投入纖維素糖化液中，制備生物絮凝劑.其工藝流程如圖1所示.

1.2.2 絮凝試驗

絮凝試驗效果采用絮凝率進行表征.取5 g高嶺土(化學純，平均粒度為4.5 μm)加至1000 mL的燒杯中，然后依次加入自來水1000 mL，10%的CaCl2溶液1.0 mL和10 mL發(fā)酵液(第二段發(fā)酵產(chǎn)物)，并且調(diào)節(jié)溶液pH值至7.2，之后將燒杯溶液放在攪拌儀上攪拌(快攪，慢攪)使之充分混合，靜置20 min后于波長550 nm處測定吸光度(B),以蒸餾水代替培養(yǎng)液作對照空白，于波長550 nm處測定吸光度(A),絮凝率F來表示絮凝活性[7]，見式(1).

F=(B-A)/B×100%

(1)

1.2.3 分析方法

分別取一定量的預處理后的纖維素、第一段發(fā)酵工藝中的纖維素高效糖化液的有效成分、第二段發(fā)酵中的絮凝劑發(fā)酵液，采用3,5-二硝基水楊酸 (DNS)法測定水解液中總還原糖濃度(CTRS)[8]，從而計算還原糖得率TRS[9]，見式(2)，其中m1為堿處理的纖維素質(zhì)量.

TRS=(CTRS×30)/m1×100%

(2)

2 結果與討論

2.1 纖維素結構變化

利用木質(zhì)素能夠溶于堿性溶液的特點，用堿液處理稻草，將稻草中的木質(zhì)素溶解，纖維素的形態(tài)發(fā)生變化.圖2A是未經(jīng)任何物質(zhì)處理的原稻草的顯微鏡下結構，圖2B為稻草經(jīng)堿液處理后的顯微鏡下結構，從圖中可以看出木質(zhì)素發(fā)生了一定程度的溶解，未被溶解的纖維素結構變松散，有利于纖維素被纖維素降解菌生物降解，降解的產(chǎn)物主要是含碳物質(zhì)，替代第二段發(fā)酵工藝中碳源的投入.在降解過程中還有部分纖維素未被降解，以微小顆粒存在于發(fā)酵底物中，在絮凝過程中以膠體顆粒狀態(tài)與懸浮顆粒發(fā)生吸附、架橋和網(wǎng)捕絮凝行為，參與絮凝反應過程，減少絮凝劑的投入量.

結構變松散的纖維素被纖維素降解菌所降解，表現(xiàn)在將長鏈狀纖維素(圖2C)降解成微小顆粒(圖2D).纖維素被認為是葡萄糖單體組成，是由許多葡萄糖分子以糖苷鍵相連而成直鏈.當纖維素長鏈斷開后，大部分葡萄糖以單個個體的形式存在，這些葡萄糖作為第二段發(fā)酵工藝中的絮凝菌的代謝底物的碳源，此段工藝運行即纖維素發(fā)酵的糖化過程.

圖2 纖維素結構變化

圖3 不同發(fā)酵階段發(fā)酵液的葡萄糖得率

2.2 纖維素水解糖化

取纖維素糖化段發(fā)酵液和絮凝段發(fā)酵液，未投加纖維素降解菌和絮凝菌的培養(yǎng)基作為空白對照，測定還原糖產(chǎn)率，如圖 3所示.在同樣的培養(yǎng)條件下，第一段還原糖得率12.1%，遠遠高于空白組和第二段工藝的還原糖得率，這是因為第一段工藝中的葡萄糖主要來自于稻草纖維素的生物降解，而且在稻草的預處理過程中纖維素降解也會產(chǎn)生少量的葡萄糖[10]，纖維素降解菌降解纖維素生成的葡萄糖是第二段絮凝發(fā)酵的關鍵底物，因此，第一段糖化過程產(chǎn)生的還原糖能夠滿足絮凝菌的利用.第二段絮凝發(fā)酵液中的還原糖得率有所降低，主要原因是絮凝菌在發(fā)酵過程中消耗了以葡萄糖為主的糖類物質(zhì)，因此纖維素發(fā)酵產(chǎn)生的糖類物質(zhì)大部分供絮凝菌所利用，還原糖得率降低.另一個可能原因是發(fā)酵液中發(fā)生了產(chǎn)物抑制效應，抑制作用阻遏了纖維素降解菌對底物的利用，致使纖維素降解菌利用發(fā)酵液中的還原糖以維持自身生長繁殖需要[11]，消耗了一部分還原糖.同時也要考慮纖維素降解菌和絮凝菌生長條件的差異，纖維素降解菌在利用糖后會降低發(fā)酵液的pH值，而絮凝菌更適宜在中性或弱堿性條件下生長，因此，在兩段式發(fā)酵過程中需實時監(jiān)控反應底物的pH值，維持發(fā)酵罐中酸堿平衡，促使反應順利進行.

圖4 兩種生物絮凝劑的絮凝效果

2.3 絮凝效果測定

傳統(tǒng)絮凝劑以葡萄糖為碳源，兩段式發(fā)酵生成絮凝劑則是以纖維素糖化液為碳源.比較兩種底物碳源產(chǎn)生的絮凝劑的絮凝效果(圖4).

傳統(tǒng)絮凝劑在發(fā)酵12 h時絮凝效果即可達到絮凝率92.5%，在24 h和48 h時絮凝率分別為86.3%和84.0%，隨著發(fā)酵時間的延長，生成的生物絮凝劑的絮凝率有逐漸下降趨勢，分析其原因，主要是葡萄糖易被絮凝菌F2利用，當達到碳源的利用率最高時，即絮凝劑生成的量也最多，絮凝劑的有效成分處于最佳狀態(tài)，絮凝率也就最大.隨著時間的推移，碳源逐漸降低，絮凝菌則會優(yōu)先滿足自身生長需求，為了生存會繼續(xù)消耗碳源，產(chǎn)生的絮凝劑有效成分中的糖類和蛋白類物質(zhì)會慢慢減少，絮凝劑的絮凝效果也會隨之降低.

兩段式發(fā)酵生成的絮凝劑，其絮凝效果在48 h處達到峰值.因為纖維素在纖維素降解菌的作用下，是緩慢降解，因此，仍然有部分在持續(xù)糖化，也就是說絮凝菌在第二段發(fā)酵中利用的糖類是由纖維素緩釋產(chǎn)生的，絮凝劑的絮凝效果是持續(xù)上升的.另外一個原因是當絮凝菌加入纖維素所降解的發(fā)酵液中時，纖維素降解菌仍處于一個生長旺盛階段，并不能排除兩種菌在同一生長環(huán)境中所產(chǎn)生的協(xié)同作用，而促使纖維素降解菌繼續(xù)產(chǎn)生有機碳，絮凝菌得到大量的可利用碳源，提高了代謝速度，同時代謝產(chǎn)物也相應增加，生物絮凝劑的有效成分也隨之增加[12].48 h之后，絮凝劑的絮凝率有所下降，這是因為纖維素降解產(chǎn)生的糖類達到一定限值之后，供應絮凝菌的糖類減少，產(chǎn)生的絮凝劑的有效成分也在慢慢減少，絮凝劑的絮凝效果則隨之降低.

3 結論

在兩段式發(fā)酵工藝中，糖化階段產(chǎn)物的質(zhì)量是生物絮凝劑高效的前提條件.第一階段糖化過程中，還原糖得率12.1%，第二階段產(chǎn)生的絮凝劑的絮凝率為82.1%.

兩段式發(fā)酵是利用廉價稻草作為底物碳源，生產(chǎn)高效生物絮凝劑的一種工藝.糖化產(chǎn)生的還原糖被絮凝劑利用，減少了絮凝劑生成中的碳源投加量，降低了絮凝劑的生產(chǎn)成本，且絮凝效果好.也進一步驗證了纖維素降解菌和絮凝菌在相同培養(yǎng)環(huán)境下能夠共同生長，它們之間通過協(xié)調(diào)作用出現(xiàn)了生態(tài)位的分離，避免了種群間激烈的競爭，共同完成兩段發(fā)酵過程.本實驗所選的纖維素材料，為后期應用天然秸稈類纖維素等物進行發(fā)酵生產(chǎn)奠定了基礎.

致 謝 特別感謝學姐吳波的協(xié)助完成.