鄭聰聰，周海龍，趙晶晶，李憲臻，楊 帆

(1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.中國(guó)生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì)，北京 100833)

0 引 言

菊糖是一種可以生產(chǎn)燃料乙醇的優(yōu)質(zhì)能源生物質(zhì)。然而，自然界中只有極少數(shù)微生物可以直接轉(zhuǎn)化菊糖為乙醇[1-2]。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)能夠高效轉(zhuǎn)化生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇，且易于培養(yǎng)、遺傳操作平臺(tái)成熟[3]。然而，絕大多數(shù)釀酒酵母菌株不能直接水解菊糖為可發(fā)酵糖[4-5]。有文獻(xiàn)表明，蔗糖轉(zhuǎn)化酶SUC2是釀酒酵母水解菊糖的關(guān)鍵酶，它的表達(dá)水平直接影響釀酒酵母水解菊糖產(chǎn)乙醇的能力[6]。目前，天然釀酒酵母菌株中SUC2的表達(dá)水平非常低，嚴(yán)重阻礙了菊糖基乙醇的工業(yè)化生產(chǎn)進(jìn)程[7-8]。

釀酒酵母α交配因子(αF)是一種肽激素效應(yīng)物，僅由α型單倍體細(xì)胞分泌，指引該細(xì)胞與相反配型的單倍體細(xì)胞進(jìn)行接合[9]。α交配因子的前體進(jìn)入細(xì)胞的分泌系統(tǒng)，并在分泌后期被胞內(nèi)外蛋白質(zhì)水解酶加工為成熟的αF[10]。國(guó)內(nèi)外已有多項(xiàng)研究利用α交配因子的分泌信號(hào)肽融合目標(biāo)蛋白以提高其分泌表達(dá)水平，如來(lái)自馬克斯克魯維酵母的菊糖酶和羧肽酶等，均取得了較好的效果[11-13]。

目前，還沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)告利用融合分泌信號(hào)肽有效提高釀酒酵母SUC2分泌水平。本實(shí)驗(yàn)克隆獲得α交配因子的分泌信號(hào)肽編碼基因，并將其與SUC2編碼基因上游進(jìn)行融合，隨后轉(zhuǎn)化至釀酒酵母進(jìn)行分泌表達(dá)，旨在為理性改造釀酒酵母使其高效轉(zhuǎn)化菊糖產(chǎn)乙醇提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀酒酵母S.cerevisiaeBY4741、EscherichiacoliDH10B，獲贈(zèng)于大連化學(xué)物理研究所趙宗保研究員課題組。質(zhì)粒pYC230-Suc2，中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所贈(zèng)予。釀酒酵母重組菌BY-BS，本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并保藏。PrimeSTAR HS DNA 聚合酶，250 bp DNA Marker，大連寶生物有限公司；DpnI，NEB公司。

酵母發(fā)酵液體YPD培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g/L，酵母浸粉10.0 g/L，蛋白胨20.0 g/L，pH 6.0；固體YPD培養(yǎng)基：瓊脂粉15.0 g/L其余同YPD液體培養(yǎng)基，根據(jù)需要補(bǔ)加200 μg/mL G418。LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，pH 7.0；LB固體培養(yǎng)基：瓊脂粉15.0 g/L其余同LB液體培養(yǎng)基，根據(jù)需要補(bǔ)加100 μg/mL氨芐西林。

Eppendorf AG22331電擊融合儀、梯度PCR儀，德國(guó)艾本德股份有限公司；MD spectramax paradigm酶標(biāo)儀，美谷分子儀器(上海)有限公司；DYY-11型電泳儀，北京市六一儀器廠(chǎng)。

1.2 方 法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

α交配因子的分泌信號(hào)編碼基因的克隆及基因融合表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定所用引物均合成于大連寶生物有限公司。所使用的引物序列及功能如表1所示。

表1 引物序列及功能Tab.1 Sequences and functions of primers

1.2.2 α交配因子的分泌信號(hào)編碼基因的克隆

將αF分泌信號(hào)肽與部分Suc2基因融合片段共303 bp送往上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行全基因合成，合成的片段被亞克隆至pUC57，構(gòu)成pUC57-αF-Suc2。

1.2.3 融合有αF分泌信號(hào)肽的pYC-mSuc2分泌表達(dá)載體的構(gòu)建

采用RF克隆策略[19]將釀酒酵母表達(dá)載體pYC230-Suc2上的Suc2天然分泌信號(hào)肽編碼序列替換為全基因合成的αF分泌信號(hào)肽基因片段(αFSP)。RF Ⅰ反應(yīng)所用引物為pSF和pSR，以質(zhì)粒pYC230-Suc2為模板，反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。采用凝膠回收試劑盒對(duì)RF Ⅰ擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收。RF Ⅱ反應(yīng)體系：100 ng pYC230-Suc2，280 ng RF Ⅰ回收產(chǎn)物，5 μL 5×PrimerSTAR buffer，2.5 mol/L dNTPs，1.25 U PrimeSTAR HS DNA聚合酶，加水至總體積為25 μL。RF Ⅱ反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，94℃ 30 s，65 ℃ 1 min，68 ℃ 9 min，15個(gè)循環(huán)(每個(gè)循環(huán)退火溫度降低1 ℃)，之后，94 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，68 ℃ 9 min，20個(gè)循環(huán)，68 ℃ 15 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。

取9 μL RF Ⅱ反應(yīng)產(chǎn)物，加入1 μLDpnI (10 U/μL)，37 ℃消化5 h降解甲基化模板質(zhì)粒。取2.5 μL消化產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化至E.coliDH10B中，轉(zhuǎn)化菌液涂布于含終質(zhì)量濃度為100 μg/mL氨芐西林的LB平板，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行酶切驗(yàn)證。酶切體系：0.5 μg質(zhì)粒DNA，0.5 μLSalⅠ和0.5 μLSacⅠ(雙酶切)或0.5 μLPstⅠ(單酶切)，1 μL 10×buffer，加水至體積為10 μL，37 ℃溫育2 h，1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)酶切產(chǎn)物鑒定。測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pYC-mSuc2，如圖1所示。

圖1 質(zhì)粒pYC-mSuc2示意圖Fig.1 The map of plasmid pYC-mSuc2

1.2.4 分泌表達(dá)Suc2的重組釀酒酵母的構(gòu)建

將鑒定正確表達(dá)的質(zhì)粒pYC-mSuc2電擊轉(zhuǎn)化至S.cerevisiaeBY4741感受態(tài)細(xì)胞中，電壓為1 500 V。電擊結(jié)束后轉(zhuǎn)化菌液加入增加1 mol/L 山梨醇1 mL，于30 ℃溫育2 h后將轉(zhuǎn)化菌液涂布于含有200 μg/mL G418抗性篩選平板上，30 ℃培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒DNA并進(jìn)行PCR鑒定。鑒定正確的重組釀酒酵母命名為BY-mS。

1.2.5 分泌表達(dá)SUC2的釀酒酵母重組菌株酶活測(cè)定

將鑒定正確的重組酵母單菌落接種于10 mL的YPD種子液中，以30 ℃、200 r/min的培養(yǎng)條件培養(yǎng)24 h。種子液按照體積比1∶100接種于YPD液體培養(yǎng)基，于30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)48 h。發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定菌體濃度，并將發(fā)酵液稀釋至OD600為4。1 mL稀釋后的發(fā)酵菌液5 000g、4 ℃離心10 min得到已稀釋后的發(fā)酵液上清，收集菌體重懸于1 mL 0.1 mol/L PBS緩沖溶液(pH 6.8)。

酶活測(cè)定方法：取50 μL重懸菌液或稀釋后的發(fā)酵液上清與450 μL菊糖或蔗糖底物(20 g/L，pH 5.0)混勻，50 ℃水浴反應(yīng)15 min。沸水浴10 min 終止反應(yīng)。采用DNS法測(cè)定反應(yīng)釋放的還原糖[15]。

酶活定義：每分鐘水解菊糖或蔗糖釋放1 μmol 葡萄糖所需的酶量為1 U。

2 結(jié)果與討論

2.1 釀酒酵母α交配因子分泌信號(hào)肽編碼基因的全基因合成

由上海生工合成釀酒酵母α交配因子分泌信號(hào)肽編碼基因與Suc2部分編碼基因融合DNA片段被亞克隆至pUC57。構(gòu)建的重組載體pUC57-αF-Suc2送TaKaRa大連寶生物公司測(cè)序，利用軟件DNAStar中的MegAlign程序?qū)y(cè)序結(jié)果與Genebank提交的αF信號(hào)肽編碼序列和Suc2核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，如圖2所示。比對(duì)結(jié)果表明，全基因合成的核苷酸序列完全正確。DNA序列長(zhǎng)度為303 bp，其中α交配因子分泌信號(hào)肽編碼基因長(zhǎng)度為60 bp。

圖2 全基因合成αF-Suc2基因融合片段與數(shù)據(jù)庫(kù)序列比對(duì)結(jié)果Fig.2 Sequence alignment of synthesized αF-Suc2 DNA compared with the gene data from Genebank

2.2 Suc2分泌表達(dá)載體及菌株的構(gòu)建

以pUC57-αF-Suc2為模板，PCR擴(kuò)增融合α交配因子分泌信號(hào)肽編碼基因與Suc2部分編碼基因融合片段αF-Suc2，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖3所示。在300 bp附近擴(kuò)增出一條特異性條帶，大小與αF-Suc2目的基因片段一致。將回收的PCR產(chǎn)物送至上海生工測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)證明為αF-Suc2序列。

M，DNA marker；1，目的條帶圖3 PCR擴(kuò)增融合片段αF-Suc2的電泳驗(yàn)證結(jié)果Fig.3 Agarose gel electrophoresis results of αF-Suc2 fragment

為了構(gòu)建釀酒酵母蔗糖轉(zhuǎn)化酶編碼基因Suc2的分泌表達(dá)載體，利用RF克隆策略將Suc2自身的分泌信號(hào)肽替換為α交配因子分泌信號(hào)肽。將RF克隆產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH10B感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取。對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行SalⅠ/SacⅠ雙酶切以及PstⅠ單酶切驗(yàn)證。電泳結(jié)果如圖4所示，重組質(zhì)粒經(jīng)SalⅠ/SacⅠ雙酶切后顯示有大小為3 901和5 690 bp兩條特異性條帶，PstⅠ單酶切后顯示有大小為1 791和7 800 bp的兩條特異性條帶，與預(yù)測(cè)正確重組質(zhì)粒的酶切結(jié)果基本一致。將酶切鑒定正確的質(zhì)粒送上海生工測(cè)序，結(jié)果表明成功構(gòu)建了蔗糖轉(zhuǎn)化酶分泌表達(dá)載體pYC-mSuc2。

將表達(dá)載體pYC-mSuc2轉(zhuǎn)化至S.cerevisiaeBY4741感受態(tài)細(xì)胞中，30 ℃靜置培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆提取重組質(zhì)粒并進(jìn)行PCR鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖5所示。擴(kuò)增產(chǎn)生大小為300 bp的特異性條帶，與理論P(yáng)CR驗(yàn)證DNA產(chǎn)物大小基本一致。該結(jié)果表明成功構(gòu)建了分泌表達(dá)蔗糖轉(zhuǎn)化酶的重組釀酒酵母BY-mS。

2.3 分泌表達(dá)SUC2的釀酒酵母重組菌株酶活力

將重組釀酒酵母BY-mS分泌表達(dá)SUC2的能力與未替換分泌信號(hào)肽的對(duì)照菌株BY-BS進(jìn)行比較，結(jié)果如圖6和圖7所示。在發(fā)酵48 h條件下，BY-mS重組菌全細(xì)胞菊糖酶活力為2.6 U/mL、發(fā)酵液上清菊糖酶活力為3.4 U/mL，均顯著高于對(duì)照菌株BY-BS。BY-mS重組菌全細(xì)胞蔗糖酶活力為34.5 U/mL，顯著高于對(duì)照菌株BY-BS；而該菌株發(fā)酵液上清蔗糖酶酶活力為9.7 U/mL，與對(duì)照菌株無(wú)顯著性差異。結(jié)果表明，相對(duì)于SUC2自身的天然分泌信號(hào)肽，α交配因子分泌信號(hào)肽的融合能夠有效地提高SUC2在釀酒酵母中的分泌水平。

M，DNA marker；1，雙酶切結(jié)果；2，單酶切結(jié)果圖4 重組質(zhì)粒pYC-mSuc2的Sal Ⅰ/Sac Ⅰ雙酶切以及 Pst Ⅰ單酶切驗(yàn)證電泳圖Fig.4 Electrophoresis results of the recombinant plasmid pYC-mSuc2 digested by Sal Ⅰ/Sac Ⅰ and Pst Ⅰ

M，DNA marker；1～6，PCR鑒定結(jié)果圖5 轉(zhuǎn)化有pYC-mSuc2的釀酒酵母重組菌株鑒定結(jié)果Fig.5 PCR identification results of the recombinant strain transformed with plasmid pYC-mSuc2

圖6 重組釀酒酵母BY-mS和BY-BS全細(xì)胞及發(fā)酵液上清菊糖酶活力比較Fig.6 Comparison of inulinase activities in the whole cells and fermentation supernatant of the recombinant strain BY-mS and BY-BS

圖7 重組釀酒酵母BY-mS和BY-BS全細(xì)胞及發(fā)酵液上清蔗糖酶活力比較Fig.7 Comparison of sucrase activities in the whole cells and fermentation supernatant of the recombinant strain BY-mS and BY-BS

此外，從全細(xì)胞和發(fā)酵液上清的酶活力數(shù)據(jù)可以看出，SUC2在釀酒酵母細(xì)胞中表達(dá)后，能夠分泌到細(xì)胞壁和發(fā)酵液上清中。從不同分泌場(chǎng)所中的酶活差異可以推測(cè)出，SUC2分泌定位于細(xì)胞壁表面時(shí)的構(gòu)象更加利于蔗糖酶活力的展示，而當(dāng)SUC2分泌至發(fā)酵液上清中時(shí)，結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致菊糖酶活力更高。

3 結(jié) 論

全基因合成獲得釀酒酵母α交配因子分泌信號(hào)肽編碼基因，并將其融合至蔗糖轉(zhuǎn)化酶Suc2編碼基因的上游，實(shí)現(xiàn)了釀酒酵母中SUC2的分泌表達(dá)。當(dāng)重組菌在發(fā)酵48 h時(shí)，相較于含有天然分泌信號(hào)肽的SUC2，α交配因子分泌信號(hào)肽能夠有效提高SUC2在釀酒酵母中的分泌表達(dá)水平，使得重組菌株展現(xiàn)出更高的蔗糖酶活力及菊糖酶活力。此時(shí)，SUC2分別分泌在細(xì)胞壁和發(fā)酵液上清兩個(gè)部位。當(dāng)SUC2分泌在細(xì)胞壁時(shí)的構(gòu)象，更加有利于展現(xiàn)蔗糖酶活力；而當(dāng)SUC2分泌在發(fā)酵液上清時(shí)，更加有利于展現(xiàn)菊糖酶活力。