樂(lè)彩虹，陶寧萍, 2*，徐逍

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306)3(江蘇中洋生態(tài)魚類股份有限公司，江蘇 南通, 226600)

河豚是鲀形目、鲀科各屬魚類的統(tǒng)稱[1]。河豚魚又名氣泡魚，其肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，深受人們喜愛，但野生河豚體內(nèi)所含有的河豚毒素化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，難以破壞[2]。經(jīng)過(guò)20多年的發(fā)展，我國(guó)養(yǎng)殖技術(shù)逐漸成熟，養(yǎng)殖的河豚大多數(shù)已達(dá)無(wú)毒級(jí)，主要養(yǎng)殖暗紋東方鲀與紅鰭東方鲀兩種類型。據(jù)2020年漁業(yè)年鑒[3]可知，2019年河豚淡水養(yǎng)殖和海水養(yǎng)殖產(chǎn)量分別為0.99萬(wàn)t和1.75萬(wàn)t，是國(guó)外主要的無(wú)毒河豚供應(yīng)源[4]。魚皮是魚類加工副產(chǎn)物，含有大量膠原蛋白，但只有一小部分比例魚皮用于生產(chǎn)皮革材料和動(dòng)物飼料等，大部分被丟棄而造成浪費(fèi)與污染[5]。暗紋東方鲀魚皮膚分內(nèi)外兩層，體表有刺，同大多數(shù)魚皮一樣，含有大量的膠原蛋白，是提取膠原蛋白肽理想的原料[6]。

膠原蛋白肽是以膠原蛋白為原料，在酸、堿、熱處理或酶解的作用下得到的一種產(chǎn)物[7]，具有良好的生物活性[8-9]。1952年有研究者首次提出蛋白酶解物具有苦味，這種苦味是由多肽引起的而不是游離氨基酸[10]。GORDON等[11]在1965年第一次報(bào)道了在乳清培養(yǎng)發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生具有苦味的肽?？辔峨囊彩且环N生物活性肽[12]，但苦味很難讓人接受，其苦的呈現(xiàn)味主要與肽的疏水性氨基酸有關(guān)，由肽中疏水性氨基酸的組分和序列決定[13]。目前對(duì)苦味進(jìn)行脫苦的方法主要有選擇分離法[14]、掩蓋法[15]、酶法[16]和微生物法[17]，其中活性炭吸附法屬于選擇分離法類，活性炭比表面積大、微孔數(shù)量多、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、pH范圍廣，且完全不溶于水和其他溶劑[18]，常被用于作為吸附劑脫苦。硅藻土具有較大的表面積和孔體積，因而具有較強(qiáng)的吸附能力，其作為助濾劑，還有去除異味的功能[19]。MURRAY等[20]最先采用活性炭對(duì)酪蛋白水解物進(jìn)行苦味的脫除。徐錦等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在活性炭添加量為0.6%，時(shí)間為1.5 h，溫度50 ℃條件下，草魚蛋白水解液的苦味能很好的去除。張瑞瑞等[22]用硅藻土作為助濾劑對(duì)羅非魚酶解液進(jìn)行脫苦取得了一定的效果。

本文選用暗紋東方鲀魚皮，用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy,SEM)對(duì)其微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，并在前期優(yōu)化提取和脫苦工藝的基礎(chǔ)上，采用復(fù)合蛋白酶提取膠原蛋白肽，用活性炭和硅藻土對(duì)其酶解液進(jìn)行吸附脫苦，以感官評(píng)價(jià)結(jié)合電子舌、氨基酸組成和氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)分析評(píng)價(jià)脫苦效果，以期為暗紋東方鲀魚皮的精深加工以及膠原蛋白肽酶解液苦味的脫除提供理論依據(jù)，從而創(chuàng)造更大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)所用原料暗紋東方鲀魚皮[獲得時(shí)間2020年6月13日，魚皮長(zhǎng)(22.46±0.73) cm，重(28.33±5.12) g，背面呈褐色，腹面呈白色，周圍呈黃色]，由江蘇中洋生態(tài)魚類股份有限公司提供。

HCl、H2SO4、高氯酸均為分析純，上海柯靈斯試劑有限公司；NaOH、硼酸、石油醚、氯胺T(3H2O·N-氯-對(duì)甲苯磺酰胺鈉鹽)、一水檸檬酸、無(wú)水乙酸鈉、正丙醇、異丙醇、檸檬酸鈉、苯酚均為分析純，羥脯氨酸(4-羥基-α-吡咯甲酸)標(biāo)準(zhǔn)品為色譜級(jí)，活性炭、硅藻土為食品級(jí)，上海麥克林生物科技有限公司；復(fù)合蛋白酶(酶活1.5 AU/g，由地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵而得)，諾維信生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Kjeltec 8400全自動(dòng)凱氏定氮儀，丹麥FOSS公司；Soxtec 2050自動(dòng)索式抽提儀，丹麥FOSS公司；HP10電熱板，德國(guó)艾卡公司；FineBox-6100 馬弗爐，浙江泛泰儀器有限公司；UV-2200 紫外分光光度計(jì)，美國(guó)Unico公司；TG16-WS 臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；HWS-24 電熱恒溫水浴鍋，上海恒科學(xué)儀器有限公司；Hitachi S-3400 N 掃描電鏡，日立高新技術(shù)公司；L-8800 氨基酸自動(dòng)分析儀，日本日立公司；DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上?；厶﹥x器制造有限公司；FD-80真空干燥箱，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；ASTREE電子舌，法國(guó)Alpha MOS公司；6 890-5975B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 暗紋東方鲀魚皮基本營(yíng)養(yǎng)成分和膠原蛋白含量測(cè)定

1.3.1.1 樣品處理

暗紋東方鲀魚皮切成1 cm×1 cm左右大小粒狀，分裝于自封袋，置于-40 ℃冰箱保存待用。

1.3.1.2 基本營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定

水分含量測(cè)定：參照GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》。蛋白質(zhì)含量測(cè)定：參照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》。脂肪含量測(cè)定：參照GB 5009.6—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》?；曳趾繙y(cè)定：參照GB 5009.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測(cè)定》。

1.3.1.3 膠原蛋白含量測(cè)定

參照GB/T 9695.23—2008《肉與肉制品 羥脯氨酸含量測(cè)定》，采用分光光度法測(cè)定魚皮中羥脯氨酸含量，乘以系數(shù)11.1[23]便可得暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白含量。

1.3.2 暗紋東方鲀魚皮掃描電子顯微鏡結(jié)構(gòu)觀察

參照王超[24]的方法并稍作修改，將潔凈的鋁箔片粘于樣品盤上，選取均勻的暗紋東方鲀魚皮內(nèi)外兩層皮膚分別粘于鋁箔片上，將樣品盤置于離子濺射儀的樣品艙中，噴金5 min，將樣品盤放入掃描電子顯微鏡觀察室，選取清晰視野進(jìn)行觀察。

1.3.3 暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液的提取與脫苦

按照實(shí)驗(yàn)室前期優(yōu)化提取工藝，在酶添加量為2%，溫度53 ℃的條件下用復(fù)合蛋白酶處理暗紋東方鲀魚皮1.5 h，即為脫苦前膠原蛋白肽酶解液。移取一部分酶解液用于脫苦，按照實(shí)驗(yàn)室前期優(yōu)化脫苦條件，在活性炭與硅藻土添加量為6%，活性炭與硅藻土添加比例為1∶5(質(zhì)量比)，溫度65 ℃，時(shí)間20 min的條件下對(duì)暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液進(jìn)行脫苦，即為脫苦后多肽酶解液。

1.3.4 暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后滋味感官分析

參照潘印卿[25]的方法并稍作修改，選取檸檬酸、蔗糖、咖啡粉、食鹽和味精分別作為酸、甜、苦、咸和鮮的標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)應(yīng)的濃度及分值如表1所示。

表1 不同濃度滋味標(biāo)準(zhǔn)品評(píng)分值Table 1 Standard tasting scores of different concentrations of taste

選取10名(5男5女)經(jīng)過(guò)專業(yè)培訓(xùn)的感官品評(píng)員進(jìn)行感官分析，10名感官品評(píng)員在感官評(píng)價(jià)過(guò)程中全程無(wú)交流。取其中一個(gè)味道的低濃度標(biāo)準(zhǔn)品放入口中感受其滋味，5 s后吐出，用水漱口，接著品嘗下一個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品，至全部濃度感受完成；取樣品少量放入口中感受其滋味，5 s后吐出，用水漱口，3 min后品嘗下一個(gè)樣品。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)應(yīng)的分值對(duì)樣品進(jìn)行對(duì)照打分，得到樣品的分值。剩余味道分析同上。

1.3.5 暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后電子舌分析

本實(shí)驗(yàn)所用電子舌傳感器能直接檢測(cè)出酸、咸、鮮3種滋味響應(yīng)值，苦和甜響應(yīng)值需以標(biāo)準(zhǔn)添加的方式獲得，具體添加方法如下：稱取不同質(zhì)量咖啡粉和蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品分別加入暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽脫苦前酶解液中，使得苦味和甜味濃度梯度均為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25和0.30 g/100mL。參照周紛等[26]的方法稍作修改，各移取2 mL脫苦前后暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液和苦味、甜味不同濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)添加樣品于離心管中，加入25 mL超純水，超聲5 min，在冷凍離心機(jī)中以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，過(guò)濾至100 mL容量瓶，用超純水定容，移取5 mL于電子舌專用進(jìn)樣杯中，超純水定容至80 mL，室溫條件下進(jìn)行測(cè)定。電子舌傳感器每次檢測(cè)后均用去離子水進(jìn)行清洗，清洗周期10 s。

1.3.6 暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后氨基酸組成分析

參照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測(cè)定進(jìn)行測(cè)定》，分別稱取暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽脫苦前后酶解液各0.300 0 g于水解管中，加入10 mL 6 mol/L HCl，再加入3滴苯酚，抽真空，立即封口，放入110 ℃干燥箱中水解22 h，取出冷卻至室溫，打開水解管，酶解液過(guò)濾至50 mL容量瓶中，少量水沖洗水解管，合并水解液，用水定容，吸取1 mL濾液于15 mL試管中，放入50 ℃真空干燥箱中真空干燥，蒸干，殘留物再用1 mL水溶解，再放入50 ℃真空干燥箱中真空干燥，蒸干，加入2 mL pH 2.2檸檬酸鈉緩沖液溶解，振蕩混勻，用0.22 μm水相膜過(guò)濾至進(jìn)樣瓶中，采用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行測(cè)定。

1.3.7 暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后GC-MS分析

參照TAN等[27]的方法并稍作修改，采用65 μm DVB/ PDMS萃取頭，各吸取暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽脫苦前后酶解液5 mL于頂空瓶中，再加入5 mL 0.18 mol/L NaCl以促進(jìn)揮發(fā)，在50 ℃水浴鍋中萃取45 min,迅速將SPME針插入GC-MS進(jìn)樣口進(jìn)行分析。

色譜條件：HP-5 ms彈性毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；程序升溫：初始溫度30 ℃，保持3 min，以8 ℃/min升至70 ℃，5 ℃/min升至150 ℃，5 ℃/min升至260 ℃保持5 min，載氣(He)流速1.5 mL/min。

質(zhì)譜條件：電子電離源；解吸時(shí)間5 min；電子能量70 eV；燈絲發(fā)熱電流200 μA；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；傳輸線溫度280 ℃；檢測(cè)器電壓1.2 kV；質(zhì)量掃描范圍m/z50～350。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(mean±S.D.)的形式表示。采用SPSS 23.0軟件，根據(jù)單因素方差(One-Way ANOVA)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性比較分析，電子舌結(jié)果采用Alpha Soft 軟件進(jìn)行分析；Origin 8.6(Origin Lab，USA)軟件用于處理和生成圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 暗紋東方鲀魚皮基本營(yíng)養(yǎng)成分和膠原蛋白含量

表2為暗紋東方鲀魚皮基本營(yíng)養(yǎng)成分和膠原蛋白含量。由表2可知，暗紋東方鲀魚皮水分含量為75.03%，灰分含量為1.14%，粗脂肪含量?jī)H為0.09%，粗蛋白含量為23.39%。其粗蛋白含量高于比目魚皮[28]、鳙魚魚皮[29]等；粗脂肪含量低于大西洋鮭魚魚皮[30]、鱈魚魚皮[31]、比目魚皮[32]等。可見暗紋東方鲀魚皮是一種高蛋白低脂肪的原料，且膠原蛋白含量高達(dá)18.99%，占總蛋白含量的81.19%，其膠原蛋白含量高于鱈魚魚皮[31]、鯉魚皮、魷魚皮[32]。由此可知暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白含量豐富，是提取膠原蛋白肽理想的原料。

表2 暗紋東方鲀魚皮基本營(yíng)養(yǎng)成分和膠原蛋白含量 單位：g/100gTable 2 Nutrient composition and collagen content of Takifugu obscurus skin

2.2 暗紋東方鲀魚皮掃描電子顯微鏡結(jié)構(gòu)觀察

暗紋東方鲀魚皮體表有刺，皮膚分內(nèi)外2層。外層皮膚擴(kuò)展時(shí)很快變硬，身上的刺豎起，既能進(jìn)攻，也能防范；內(nèi)層皮膚能協(xié)助穩(wěn)固外皮層的刺和防止自身受傷害。暗紋東方鲀魚皮可以最大限度拉伸擴(kuò)展成一個(gè)球形，這可能是因?yàn)槠浜写罅康哪z原蛋白和彈性蛋白[33]。

暗紋東方鲀魚皮掃描電子顯微鏡微觀結(jié)構(gòu)如圖1所示。圖1-a是暗紋東方鲀魚皮外層皮膚在35×下的掃描電鏡圖，可以看到外層皮膚表面全是刺，這些刺呈規(guī)則排列，似釘子狀，這是暗紋東方鲀魚皮具有良好性質(zhì)的基礎(chǔ)；圖1-b是外層皮膚上的某一根刺在300×下的掃描電鏡圖，可以看到在刺的尖部有很多長(zhǎng)短不一的類似絨毛一樣的形狀，其具體成分和性質(zhì)有待進(jìn)一步研究；圖1-c是暗紋東方鲀魚皮內(nèi)層皮膚在100×下的掃描電鏡圖，可以看到內(nèi)層皮膚整體來(lái)看不平整，有褶皺，類似起伏不平的小山丘狀，這可能是因?yàn)榘导y東方鲀魚皮能夠自由收縮而導(dǎo)致的；圖1-d是內(nèi)層皮膚在300×下的掃描電鏡圖，可知內(nèi)層皮膚放大后呈排列不規(guī)則的纖維狀，還可見其中有一些大小不一的空隙。由暗紋東方鲀魚皮掃描電子顯微鏡圖可知，暗紋東方鲀魚皮具有很好的性質(zhì)，多纖維、褶皺、有彈性，是提取膠原蛋白肽的理想原料。

a-外皮，35×；b-外皮，300×；c-內(nèi)皮，100×；d-內(nèi)皮，300×圖1 暗紋東方鲀魚皮掃描電子顯微鏡圖Fig.1 SEM image of Takifugu obscurus skin

2.3 暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后滋味感官分析

本實(shí)驗(yàn)感官評(píng)分采用十分制，酸、甜、苦、咸、鮮標(biāo)準(zhǔn)品濃度越大，滋味評(píng)分越高。將10名感官品評(píng)員對(duì)暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后5種滋味的感官評(píng)價(jià)平均分制得柱狀圖如圖2所示，可直觀看出脫苦前后5種滋味變化情況。

由圖2可知，在5種滋味中，咸味感官評(píng)分最高，可能與人工養(yǎng)殖暗紋東方鲀水質(zhì)環(huán)境有關(guān)，且暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液在脫苦前后咸味無(wú)顯著性變化(P>0.05)；鮮味感官評(píng)分次之，且酶解液在脫苦前后鮮味也無(wú)顯著性變化(P>0.05)，可以看出暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液以咸鮮味為主；暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液在脫苦前苦味感官評(píng)分為4.8，脫苦后降低為3.3(P<0.05)，說(shuō)明用活性炭和硅藻土對(duì)暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液進(jìn)行吸附脫苦取得了一定的效果，這與呂錦弟等[34]用復(fù)合吸附劑脫除酪蛋白磷酸肽的苦味結(jié)果一致；暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后酸味與甜味均不明顯，感官評(píng)分也較低，苦味的脫除使酸味與甜味感官評(píng)分均高于脫苦前(P<0.05)。

圖2 暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后滋味感官評(píng)分Fig.2 The taste sensory scores of collagen peptide enzymatic hydrolysate from Takifugu obscurus skin before and after debittering注:字母不同代表差異顯著(P<0.05)，字母相同代表差異不顯著(P>0.05)(下同)

2.4 暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后電子舌分析

電子舌人工傳感系統(tǒng)是一種新穎而快速的分析技術(shù)，受到了越來(lái)越多的關(guān)注[35]，可以對(duì)樣品的滋味差異進(jìn)行評(píng)定。

圖3為暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后滋味的主成分分析圖。由圖3可知，脫苦前后主成分PC1和PC2貢獻(xiàn)率分別為91.085%和8.79%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為99.875%，接近100%，表明主成分PC1、PC2包含了大量樣品原始數(shù)據(jù)，可以整體反映樣品信息[36]。判別指數(shù)(discrimination index，DI)是區(qū)分樣品之間差異的表征值，該值越大，區(qū)分效果越好，本實(shí)驗(yàn)DI為94%，表明樣品之間區(qū)分度大。不同樣品之間滋味差異可以通過(guò)樣品在主成分分析圖中的距離遠(yuǎn)近來(lái)表征，樣品間距離越遠(yuǎn)說(shuō)明樣品差異越大。由圖3可以看到，暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后分別分布于主成分分析圖中不同區(qū)域，脫苦前分布于2、3象限，脫苦后分布于1、4象限，且距離較遠(yuǎn)，表明脫苦前后樣品滋味差異較大，能起到很好的區(qū)分作用。

圖3 暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后滋味主成分分析Fig.3 Analysis of taste principal components of collagen peptide enzymatic hydrolysate from Takifugu obscurus skin before and after debittering

為了更直觀看出電子舌系統(tǒng)傳感器對(duì)暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后滋味的響應(yīng)強(qiáng)度，制得雷達(dá)圖，如圖4所示(坐標(biāo)軸表示滋味響應(yīng)值)。由圖4可知，電子舌傳感器對(duì)脫苦前后2種酶解液的5種滋味均具有響應(yīng)，但敏感程度各不相同?？辔俄憫?yīng)值離散程度較大，說(shuō)明它能更好地區(qū)分不同樣品[37]。暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液在脫苦后苦味響應(yīng)值為5.2，低于脫苦前響應(yīng)值6.8，兩者存在顯著性差異(P<0.05)，說(shuō)明暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液經(jīng)活性炭和硅藻土吸附脫苦后取得了一定的脫苦效果，和感官評(píng)分結(jié)果相符。暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后咸味響應(yīng)值分別為 5.9和6.0，鮮味響應(yīng)值都為6.0，說(shuō)明酶解液在脫苦前后咸味和鮮味均無(wú)顯著性變化(P>0.05)，且酶解液脫苦后酸味和甜味響應(yīng)值均高于脫苦前(P<0.05)，這與感官評(píng)分結(jié)果一致。

圖4 暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后滋味雷達(dá)圖Fig.4 Taste radar image of collagen peptide enzymatic hydrolysate from Takifugu obscurus skin before and after debittering

2.5 暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后疏水性氨基酸變化

有研究[38]表明在蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中,大部分疏水性氨基酸側(cè)鏈藏在內(nèi)部,而當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)水解成小分子肽時(shí),肽鏈中疏水性氨基酸殘基就暴露出來(lái),從而產(chǎn)生苦味。多肽中疏水基團(tuán)的數(shù)目會(huì)影響苦味閾值的大小，當(dāng)疏水性較大的氨基酸在肽段中所占的比例增大時(shí)，產(chǎn)生的苦味也會(huì)隨之變強(qiáng)[39-40]。

表3為暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后氨基酸含量的變化。由表3可知，暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液中甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸含量相對(duì)較高，這與RUI等[41]的研究結(jié)果一致，符合膠原蛋白氨基酸組成特征。本實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)出18種氨基酸，其中有7種疏水性氨基酸，分別是苯丙氨酸、丙氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和脯氨酸。圖5-a為暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后總氨基酸變化，可見18種氨基酸含量在脫苦前后均有顯著性變化(P<0.05)，表明暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液被活性炭和硅藻土吸附后會(huì)改變其氨基酸含量；圖5-b為暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后疏水性氨基酸變化，可以看到暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液在脫苦后7種疏水性氨基酸含量均有不同程度減少，且酶解液在脫苦前疏水性氨基酸總含量為33.63%，脫苦后下降到29.75%，具有顯著性差異(P<0.05)，說(shuō)明用活性炭和硅藻土對(duì)暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液中的苦味物質(zhì)進(jìn)行吸附脫苦起到了一定的效果，這與解銘[42]的研究結(jié)果一致。且必需氨基酸含量在脫苦前后無(wú)明顯變化，說(shuō)明用活性炭和硅藻土對(duì)暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液進(jìn)行脫苦不會(huì)影響其必需氨基酸含量。

表3 暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后氨基酸含量Table 3 The contents of amino acids of collagen peptide enzymatic hydrolysate from Takifugu obscurus skin before and after debitter

a-總氨基酸；b-疏水性氨基酸圖5 暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后氨基酸變化Fig.5 Amino acid changes of collagen peptide enzymatic hydrolysate from Takifugu obscurus skin before and after debittering

2.6 暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后揮發(fā)性物質(zhì)變化

呈苦味的揮發(fā)性物質(zhì)會(huì)隨著活性炭和硅藻土的添加而被吸附，從而導(dǎo)致脫苦前后含量變化。表4為暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量。由表4可知，暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后揮發(fā)性物質(zhì)共檢出29種，其中有11種相同的物質(zhì)。

表4 暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)含量Table 4 The relative contents of volatile substances of collagen peptide enzymatic hydrolysate from Takifugu obscurus skin before and after debittering

暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前共檢測(cè)出16種物質(zhì)。酚類物質(zhì)最多，共檢出6種，占總物質(zhì)含量的46.29%，其中對(duì)乙酰氨基酚呈苦味，相對(duì)含量較高，為26.58%，這可能是導(dǎo)致暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液呈苦味的原因之一，2,4-二叔丁基苯酚則呈甜香味[43]，相對(duì)含量較少，為2.08%；酯類物質(zhì)檢出3種，占總物質(zhì)含量的30.58%，主要是鄰苯二甲酸二異丁酯，含量為24.34%，呈芳香氣味[44]；醇類物質(zhì)檢出2種，占總物質(zhì)含量的5.06%，主要有1-辛烯-3-醇，呈蘑菇、薰衣草香[45]，2,6,6,8-四甲基三環(huán)[5.3.1.0]十一烷-8-醇(柏木腦)，有膏香及木香氣味[46]；醛類物質(zhì)檢出2種，占總物質(zhì)含量的6.24%，主要是壬醛，呈油脂香[46]，4-庚烯醛，呈青草香味；烴類物質(zhì)檢出1種，主要是α-柏木烯，相對(duì)含量為0.52%；芳香族類物質(zhì)檢出1種，主要是間二甲苯，相對(duì)含量為2.40%，具有甜香、花香氣味；同時(shí)還檢測(cè)出了2-乙基呋喃，相對(duì)含量為8.92%，呈焦香香味、辛辣味[46]。1-辛烯-3-醇、4-庚烯醛和2-乙基呋喃只在脫苦前暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液中檢出，且三者閾值(見表4)都很低，可見其對(duì)脫苦前暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液的風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。

暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液脫苦后共檢測(cè)出24種物質(zhì)。酚類物質(zhì)最多，共檢出6種，占總物質(zhì)含量的21.98%，其中對(duì)乙酰氨基酚相對(duì)含量為4.36%，較脫苦前來(lái)說(shuō)呈顯著降低(P<0.05)，說(shuō)明用活性炭和硅藻土對(duì)乙酰氨基酚的脫除效果顯著；酯類物質(zhì)檢出4種，占總物質(zhì)含量的46.59%，較脫苦前增加了16%，可見用活性炭和硅藻土對(duì)暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液脫苦后酯類物質(zhì)含量會(huì)增加，且檢出了脫苦前未有的癸二酸二異丙酯，相對(duì)含量為7.37%；醇類物質(zhì)檢出6種，占總物質(zhì)含量的27.26%，主要有脫苦前酶解液未有的異辛醇(呈玫瑰味[47])、十二醇(呈花香味和脂肪味[48])、1-庚醇，呈脂味和酒香味[49]，可見暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液在脫苦后醇類物質(zhì)也會(huì)相應(yīng)增加；醛類物質(zhì)檢出1種，主要是壬醛，相對(duì)含量為1.05%；烴類物質(zhì)檢出3種，占總物質(zhì)含量的1.81%，主要有脫苦前未有的正十三烷，呈柑橘香[50]；芳香族類物質(zhì)檢出1種，主要是1,4-二甲苯，相對(duì)含量為0.45%，具有芳香氣味；酮類物質(zhì)檢出2種，占總物質(zhì)含量的0.62%，主要有2-莰酮(呈樟木氣味)、香葉基丙酮(呈木蘭香氣和花香[44])，可見暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液在脫苦后會(huì)檢出了酮類物質(zhì)；同時(shí)還檢測(cè)出2,6-二叔丁基苯醌，相對(duì)含量為0.23%。十二醇、香葉基丙酮和1,4-二甲苯只在脫苦后暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液中檢出，且三者閾值也較低，可見其對(duì)脫苦后暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液的風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。

3 結(jié)論

本研究對(duì)暗紋東方鲀魚皮基本營(yíng)養(yǎng)成分和膠原蛋白含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，暗紋東方鲀魚皮粗蛋白含量為23.39%，粗脂肪含量為0.09%，且膠原蛋白含量占總蛋白含量的81.19%，說(shuō)明暗紋東方鲀魚皮是提取膠原蛋白肽的理想原料。采用掃描電鏡對(duì)暗紋東方鲀魚皮內(nèi)外2層皮膚微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，結(jié)果表明，暗紋東方鲀魚皮外層皮膚的刺排列規(guī)則；內(nèi)層皮膚則有褶皺，不平整?；趯?shí)驗(yàn)室前期優(yōu)化的提取和脫苦工藝，用復(fù)合蛋白酶在酶添加量為2%，溫度53 ℃，時(shí)間1.5 h的條件下提取暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽，并用活性炭和硅藻土在添加量為6%，質(zhì)量比為1∶5，溫度65 ℃，時(shí)間20 min的條件下對(duì)其酶解液進(jìn)行吸附脫苦，以感官評(píng)價(jià)結(jié)合電子舌、氨基酸組成和GC-MS分析評(píng)價(jià)脫苦效果。結(jié)果表明，暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽酶解液經(jīng)活性炭和硅藻土脫苦后，苦味感官評(píng)分為3.3，低于脫苦前4.8(P<0.05)；脫苦后經(jīng)電子舌分析苦味響應(yīng)值為5.2，低于脫苦前苦味響應(yīng)值6.8(P<0.05)；脫苦后疏水性氨基酸含量為29.75%，低于脫苦前疏水性氨基酸含量33.63%(P<0.05)；脫苦后呈苦味的物質(zhì)對(duì)乙酰氨基酚相對(duì)含量為4.36%，低于脫苦前相對(duì)含量26.58%(P<0.05)。本研究對(duì)暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽進(jìn)行脫苦后，將進(jìn)一步模擬體外胃腸消化對(duì)膠原蛋白肽的消化性能進(jìn)行研究探討。