鞏一博 郭雅圖 張偉

年齡相關性黃斑變性(AMD)是一種年齡相關性的視網(wǎng)膜退行性病變，AMD產(chǎn)生的原因目前尚未完全明確，其誘發(fā)因素可能與直接強光暴露、飲食中缺乏抗氧化的食物等有關[1-3]。隨著人口老齡化的發(fā)展，至2020年，在全球患有AMD的人數(shù)將有可能達到2億，至2040年可能增加到3億，并且發(fā)病具有年輕化趨勢[4]。早期的AMD主要表現(xiàn)為玻璃膜的聚集及視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細胞的破壞，后期則逐漸可以分為干性和濕性兩種類型，干性AMD主要為視網(wǎng)膜地圖樣萎縮，濕性AMD主要以新生血管為主[5-6]。這兩種類型可以獨立存在，也可以相繼發(fā)生，其關系目前尚未完全明確。因為對發(fā)病機制認識不完全清晰，尚沒有預防AMD的有效措施。

菊花在我國種植廣泛，有研究表明，菊花提取液在多種不同色光照射下可以產(chǎn)生抗氧化損傷的作用[7]。菊花具有較強的清除氧自由基和較好的還原能力[8]。其含有的黃酮、多糖等，尤其黃酮小分子物質具有較好的抗氧化作用[9]。AMD的發(fā)生與光感受器細胞的氧化應激有關[10]。小鼠急性及慢性光損傷是研究常用的光損傷模式，本研究旨在證明菊花提取液在小鼠視網(wǎng)膜光損傷中的保護作用，并探討其對AMD的預防性作用。

1 材料與方法

1.1 實驗對象及分組本實驗采用28只C57BL/6J野生型小鼠(北京斯貝福，SPF級)，6周齡，雄性，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(23±2)℃，相對濕度為55%，12 h明暗交替光照飼養(yǎng)。隨機分為對照組(8只)、模型組(8只)、菊花低劑量組(6只)、菊花高劑量組(6只)，根據(jù)2015年版《中華人民共和國藥典》及2003年版《保健食品與評價技術規(guī)范》中關于菊花的提取及劑量，菊花用水提法濃縮烘干后，粉碎成粉末，灌胃時生理鹽水混懸，在達到最低有效濃度和不產(chǎn)生毒性作用范圍內使用。菊花灌胃劑量分別為：菊花低劑量0.23 g·kg-1、菊花高劑量0.38 g·kg-1，每天0.2 mL連續(xù)灌胃8周，劑量與董璐萌等[11]的研究相近，對照組及模型組普通飼料喂養(yǎng)，食、水均自由攝取。灌胃結束1 d后，采用亞急性光損傷模式對模型組和菊花低、高劑量組采用白光照射，光照強度10 000 lux，散瞳后連續(xù)光照7 d，每天4 h，累計共28 h，光照時將每只小鼠用透明隔板隔開，避免推擠后受損不均。對照組維持在12 h明暗交替光照環(huán)境下喂養(yǎng)。

光損傷7 d后對各組小鼠分別進行活體下視網(wǎng)膜電生理(ERG)、光學相干斷層掃描(OCT)、熒光素眼底血管造影(FFA)檢查，3 d后眼動脈放血法處死小鼠并取出眼球進行HE及Tunel染色，同時取眼動脈血進行超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性檢測。

1.2 主要儀器及試劑光照設備(深圳市愛圖仕影像器材有限公司)，視覺電生理儀(德國羅蘭)，小動物視網(wǎng)膜顯微成像系統(tǒng)(Phoenix research labs,型號：Micron Ⅳ,美國)。SOD測定試劑盒、CAT測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，Tunel免疫熒光染色檢測試劑盒(美侖生物技術有限公司)，菊花提取液(天津科技大學提供)。

1.3 ERG檢測小鼠暗適應12 h后50 g·L-1水合氯醛麻醉，散瞳雙眼，將小鼠固定于動物臺上，連接參考電極于頭部，環(huán)形角膜電極固定于小鼠眼球，地極接于尾部，羅蘭視覺電生理儀記錄暗適應下光強度0.01 cds·m-2、3.00 cds·m-2及振蕩電位(OPS)波形，明適應10 min后記錄光強度為3.00 cds·m-2波形。

1.4 OCT檢查ERG檢測結束后，卡波姆眼凝膠涂眼，保持小鼠角膜透明性，瞳孔散大狀態(tài)下應用Phoenix小動物視網(wǎng)膜顯微成像系統(tǒng)對小鼠視網(wǎng)膜行OCT檢查，觀察各組小鼠視網(wǎng)膜各層形態(tài)。

1.5 FFA檢查OCT檢查結束后，100 g·L-1熒光素鈉稀釋至20 g·L-1后腹腔注射，采用Phoenix小動物視網(wǎng)膜顯微成像系統(tǒng)，在固定的GAIN值下進行FFA檢查并獲取動靜脈期小鼠視網(wǎng)膜血流圖，Angiotool應用軟件分析參數(shù)包括動靜脈期小血管面積、小血管面積百分比和血管分支點個數(shù)。

1.6 HE染色及Tunel染色FFA檢查結束3 d后待造影劑排出體外，采用眼動脈放血方法，處死小鼠，取眼球，福爾馬林固定12 h后，取部分角膜，再次浸泡固定至少8 h，脫水，石蠟包埋處理后進行HE染色及Tunel 免疫熒光染色，分析對照組、模型組、菊花低劑量及菊花高劑量組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGC)層、內核層(INL)、外核層(ONL)及視網(wǎng)膜總體細胞凋亡率。

1.7 生物化學檢測眼動脈放血處死小鼠的同時收集其眼動脈血液，4 ℃恒溫超速離心，取上清血清，測定小鼠動脈血清中SOD及CAT活性。

2 結果

2.1 OCT檢查、眼底照相及HE染色OCT檢查結果顯示，光損傷后模型組視網(wǎng)膜出現(xiàn)了明顯的RPE層下的弧形弓背向上的高反射信號，病變累及外界膜(ELM)以下的視網(wǎng)膜結構；眼底照相可見明顯的視網(wǎng)膜滲出樣改變。而對照組、菊花低劑量組及菊花高劑量組OCT檢查和眼底照相均顯示視網(wǎng)膜結構較完整平滑，未出現(xiàn)明顯的結構改變(圖1)。

圖1 各組小鼠視網(wǎng)膜OCT圖像(上圖)及眼底照相(下圖) 模型組小鼠視網(wǎng)膜在OCT圖像中出現(xiàn)了明顯的結構異常，紅色箭頭所示RPE層及光感受器細胞層結構改變，呈弓背向上高反射信號帶，眼底照相對應紅色箭頭處可見明顯的視網(wǎng)膜滲出樣改變。對照組、菊花低劑量組及菊花高劑量組小鼠視網(wǎng)膜OCT及眼底照相均未出現(xiàn)明顯異常。IPL：外叢狀層；OPL：外叢狀層；MZ：肌樣體帶；EZ：橢圓體帶；OSP：光感受器細胞外節(jié)。

HE染色：與OCT表現(xiàn)相似，對小鼠視網(wǎng)膜行HE染色結果顯示，模型組視網(wǎng)膜光感受器細胞層、RPE層破壞明顯，呈駝峰樣隆起；而對照組、菊花低劑量及菊花高劑量組小鼠視網(wǎng)膜結構完整，光感受器細胞層及RPE層未出現(xiàn)明顯損傷性改變(圖2)。

圖2 各組小鼠視網(wǎng)膜HE染色(×40) HE染色下可見模型組小鼠視網(wǎng)膜RPE層及光感受器細胞層結構破壞明顯，紅色箭頭所示RPE層隆起、不連續(xù)，光感受器細胞層結構紊亂。對照組、菊花低劑量及菊花高劑量組RPE層及光感受器細胞層結構清晰，無明顯損傷。

2.2 ERG檢測結果ERG檢測結果顯示，暗適應下0.01 cds·m-2b波振幅模型組較對照組下降41.63%，菊花低劑量組b波振幅較模型組提高83.50%，菊花高劑量組b波振幅較模型組提高120.60%；暗適應下3.00 cds·m-2a波振幅模型組較對照組下降22.28%，菊花低劑量組a波振幅較模型組提高76.45%，菊花高劑量組a波振幅較模型組提高118.50%；以上差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.01)。明適應下模型組3.00 cds·m-2a波振幅較對照組下降37.04%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；菊花低劑量組a波振幅較模型組提高26.37%，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；菊花高劑量組a波振幅較模型組提高76.45%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。明適應和暗適應下3.00 cds·m-2b波振幅各組間差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。OPS波振幅在各組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表1和表2)。

表1 各組暗適應下ERG波振幅

表2 各組明適應下ERG波振幅

2.3 FFA檢查結果小鼠后極部視網(wǎng)膜動靜脈期小血管參數(shù)分析結果顯示，小鼠視網(wǎng)膜后極部直徑2～4 mm的小血管面積：模型組較對照組增加35.65%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而菊花低劑量組較模型組降低20.89%，菊花高劑量組較模型組降低15.79%，差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。小血管面積百分比：模型組較對照組提高37.28%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；菊花低劑量組較模型組降低 20.52%，菊花高劑量組較模型組降低13.72%，差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。血管分支點個數(shù)：模型組較對照組增加64.49%,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而菊花低劑量組及菊花高劑量組較模型組分別降低34.29%及23.39%，差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)(圖3)。

圖3 各組小鼠視網(wǎng)膜動靜脈期FFA血流圖(上)及Angiotool軟件分析血流圖像后取得相關參數(shù)(下) 模型組小血管面積、小血管面積百分比及視網(wǎng)膜血管分支點個數(shù)均較對照組明顯升高，*P<0.05。

2.4 Tunel染色凋亡檢測各組視網(wǎng)膜Tunel染色結果見圖4，各組細胞凋亡率分析結果見圖5。由圖可見，模型組視網(wǎng)膜凋亡細胞明顯增多，對照組RGC凋亡率為5%±1%，模型組為55%±28%；INL細胞凋亡率對照組為2%±1%，模型組為6%±2%；ONL細胞凋亡率對照組為1%，模型組為10%±4%；視網(wǎng)膜總體細胞凋亡率對照組為1%，模型組為10%±7%；以上各組差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.01)。

圖4 Tunel染色檢測各組視網(wǎng)膜細胞凋亡 紅色為凋亡細胞，藍色為DAPI染色，可見模型組RGC層、INL、ONL細胞均有不同程度的凋亡。

菊花低劑量組RGC凋亡率較模型組降低73.18%，菊花高劑量組較模型組降低57.28%；菊花低劑量組INL細胞凋亡率較模型組降低78.31%，菊花高劑量組較模型組降低52.75%；以上差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.01)。

圖5 Image J 分析各組小鼠視網(wǎng)膜各層細胞凋亡率 與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.5 生物化學檢測小鼠動脈血清中SOD及CAT活性對照組SOD活性與模型組差異無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)，對照組CAT活性與模型組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而菊花低劑量組CAT活性較模型組提高48.57%，菊花高劑量組CAT活性較模型組提高185.12%，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。SOD活性各組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖6)。

圖6 各組小鼠血清SOD(A)及CAT(B)活性分析 其中SOD 無明顯變化；CAT活性分析顯示，與模型組比較，*P<0.05。

3 討論

氧化應激損傷和一些危險因素(如年齡、吸煙、光毒性、遺傳因素)的聯(lián)合作用下，可引起RPE細胞及光感受器細胞的氧化應激和炎癥反應的惡性循環(huán)，導致AMD的發(fā)生。光損傷可以使RPE層產(chǎn)生大量的ROS，同時誘發(fā)細胞凋亡。AMD的產(chǎn)生與亞急性炎癥相關。而氧化應激產(chǎn)生的細胞凋亡可以誘發(fā)局部炎癥反應。因此，采用強光照射并維持一定時間，有利于獲得凋亡細胞積累和亞急性炎癥的產(chǎn)生[12]。有研究[13]為證明氧化應激在AMD中的關鍵作用，在實驗中增加或降低氧化產(chǎn)物，如CEP、MDA等引起的炎癥反應和視網(wǎng)膜表型變化與AMD非常相似。老化的RPE細胞積聚一些溶酶體不可降解的物質，形成脂褐素。這些物質包括功能異常的線粒體，被吞噬的光感受器細胞的外節(jié)段[14]。早期階段脂褐素的沉積并不會造成細胞代謝的異常，然而隨著脂褐素的堆積，RPE細胞在體內作為永久細胞，積聚的脂褐素不能夠通過增殖的方式稀釋，占據(jù)于細胞內影響細胞線粒體及溶酶體功能長期的累及也會影響蛋白水解系統(tǒng)[15]，由于蛋白水解能力的下降導致細胞外氧化蛋白的堆積而形成玻璃膜疣。目前有研究發(fā)現(xiàn)，細胞自噬功能異常和DNA損傷性反應(DDR)是AMD發(fā)生的重要機制，其主要原因也同樣與ROS的水平增加有關。因此氧化性損傷不僅是細胞衰老的重要因素，同時也在AMD的發(fā)生發(fā)展中與炎癥反應形成了惡性的病理循環(huán)機制，因此抗氧化損傷是預防年齡相關性疾病的重要手段[16]。綜上，氧化應激反應ROS的產(chǎn)生在AMD的發(fā)生發(fā)展中都起到重要作用。

本研究中，C57BL/6J小鼠在接受光損傷后視網(wǎng)膜形態(tài)及功能出現(xiàn)明顯異常和降低。OCT圖像中，我們發(fā)現(xiàn)光損傷后小鼠RPE層下出現(xiàn)高反射信號帶，EZ(富含線粒體)受損；HE染色發(fā)現(xiàn)光感受器細胞層出現(xiàn)明顯的結構破壞，同時RPE細胞層結構異常，可見，活體及離體狀態(tài)下小鼠在接受了光損傷后視網(wǎng)膜有關對抗氧化應激功能層出現(xiàn)明顯異常，這可能與氧化應激后ROS大量產(chǎn)生、線粒體破壞、溶酶體系統(tǒng)破壞相關。從功能方面，根據(jù)全視野ERG分析方法，0.01 cds·m-2暗適應條件下b波主要反映視桿細胞功能，3.00 cds·m-2暗適應條件下反映視桿細胞及視錐細胞的混合反應，OPS波主要反映視網(wǎng)膜內層功能，3.00 cds·m-2明適應條件下，主要反映視錐細胞功能。本研究結果顯示，受到光損傷后的小鼠主要以視桿細胞系統(tǒng)功能下降為主，而這可能與小鼠視桿細胞系統(tǒng)比較發(fā)達有關。FFA檢查結果顯示，視網(wǎng)膜光損傷后視網(wǎng)膜微小血管的密度增大，這可能提示新生血管的產(chǎn)生。視網(wǎng)膜細胞各層凋亡結果顯示，光損傷后小鼠的視網(wǎng)膜各細胞層出現(xiàn)了不同程度的凋亡細胞增加，這不僅可以導致視網(wǎng)膜功能受損，同時加重視網(wǎng)膜溶酶體系統(tǒng)負擔，可能導致細胞及細胞器堆積。

菊花提取液中含有豐富的黃酮、多糖等，本研究發(fā)現(xiàn)了應用菊花提取液干預后小鼠的ERG功能、活體及離體視網(wǎng)膜形態(tài)均發(fā)生了明顯提高和改善。這與Kim等[17]研究發(fā)現(xiàn)菊花可以改善MPP+誘導的神經(jīng)元細胞活力的喪失，降低了凋亡率，增加了Bcl-2的表達的結論相一致。Sun等[18]在體外野生菊花的抗紫外線損傷的研究中也發(fā)現(xiàn)，野生菊花提取液可以降低細胞中ROS水平，有對抗紫外線損傷和皮膚老化的作用。我們進一步通過Tunel染色法同樣發(fā)現(xiàn)，光損傷后細胞凋亡明顯。模型組RGC層細胞、INL細胞、ONL細胞均有凋亡增加的趨勢，其中RGC層及INL細胞凋亡較明顯，而菊花干預的小鼠，RGC層細胞凋亡率顯著降低。血生化檢測中我們發(fā)現(xiàn)抗氧化物質CAT活性在給予菊花提取液干預后明顯提高。

綜上，我們可以推測菊花提取液對視網(wǎng)膜的這種功能及形態(tài)學上的保護可能通過對小鼠抗氧化應激刺激，減少細胞凋亡起作用。菊花提取液對視網(wǎng)膜光損傷具有一定的保護作用，增加了體內抗氧化物質的產(chǎn)生，并減少了視網(wǎng)膜細胞的凋亡，未來有可能成為一種預防性藥物用于治療AMD。