張萍玲，趙振剛

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

花色苷是植物中的主要呈色物質(zhì)，廣泛存在于草莓、黑米、紅加倫、黑豆、黑加倫、紫玉米等被子植物表皮細(xì)胞液泡中[1]。因其具有典型的C6-C3-C6骨架結(jié)構(gòu)，一般被歸為黃酮類化合物。作為一種天然食用色素，它不僅安全無(wú)毒、色彩鮮艷、資源豐富，而且具有一定的營(yíng)養(yǎng)和藥理作用，被公認(rèn)為資源最為豐富的替代苯胺類煤焦合成色素的天然色素[2,3]。作為一種生物活性物質(zhì)，它具有抗氧化[4]、抗癌[5]、抗衰老、抗炎抑菌[6]、提高視力[7]、預(yù)防心血管疾病[8]、修復(fù)和保護(hù)肝損傷、控制肥胖[9]、減輕糖尿病[10]等多種功能，在食品、醫(yī)藥、化妝品領(lǐng)域均有著巨大的應(yīng)用潛力。但其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在貯藏與加工過(guò)程中易受外界環(huán)境，如pH、溫度、光、酶、二氧化硫、金屬離子、抗壞血酸等理化因子的影響產(chǎn)生分子聚合、異構(gòu)和降解，從而失去原有的顏色[11,12]。在生理活性方面，由于花色苷的親脂性低，不易透過(guò)磷脂雙分子層的細(xì)胞膜到達(dá)靶向作用點(diǎn)，使得生理價(jià)值大大降低。故對(duì)花色苷進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾以提高它的穩(wěn)定性及生理活性成為近幾年學(xué)者的研究熱點(diǎn)。

研究證明酰基化的花色苷比未?；幕ㄉ站哂懈鼜?qiáng)的穩(wěn)定性。用脂肪酸對(duì)花色苷進(jìn)行?；磻?yīng)，可以降低花色苷在水溶性介質(zhì)中的溶解性，通過(guò)疏水作用和空間位阻效應(yīng)降低花色苷對(duì)介質(zhì)中水和亞硫酸鹽的親核攻擊的敏感性，防止花色苷分子變成無(wú)色的假堿基或查爾酮結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)花色苷的穩(wěn)定性[13]。除此之外，用脂肪酸對(duì)花色苷進(jìn)行?；?，可以提高花色苷的親脂性，有利于拓展他在脂溶性基質(zhì)中的應(yīng)用。另有研究發(fā)現(xiàn)，?；幕ㄉ诊@示出了最高的細(xì)胞模擬膜的親和力，這表明?；蠡ㄉ盏纳锢枚瓤梢缘玫胶艽筇岣遊14]。

矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）是自然界中最為常見(jiàn)、分布最廣的花色苷[15]。已有研究采用脂肪酸為?；w，通過(guò)酶法[16]或化學(xué)方法[17]對(duì)其進(jìn)行?；揎?。酶催化C3G的直接酯化需要加入具有吸附作用的堿性物質(zhì)分子篩以去除反應(yīng)的副產(chǎn)物水，導(dǎo)致C3G的大量損失，而使用化學(xué)方法進(jìn)行?；磻?yīng)存在步驟繁瑣的問(wèn)題。有機(jī)溶劑是目前非水相酶催化應(yīng)用和酶學(xué)研究最為廣泛的體系[18]。C3G作為一種多羥基化合物具有強(qiáng)親水性，在高極性有機(jī)溶劑中溶解度較高，但高極性有機(jī)溶劑可能通過(guò)剝奪酶分子表面微環(huán)境中的必需水導(dǎo)致酶的穩(wěn)定性和催化活性降低[19]，疏水性溶劑雖然可以較好得保持酶的活性，但C3G在疏水性溶劑中溶解度低[20]，同樣導(dǎo)致反應(yīng)合成效率降低?；旌先軇┯梢欢ㄅ浔鹊氖杷匀軇┖蛷?qiáng)極性溶劑互溶而成，通過(guò)改變各溶劑的配比可以改變反應(yīng)介質(zhì)的物理性質(zhì)，從而調(diào)控酶在體系中的活性以及選擇性[21]。

本研究用固定化脂肪酶Lipozyme 435為生物催化劑，以肉豆蔻酸甲酯為?；w，分別在單一有機(jī)溶劑和混合有機(jī)溶劑中對(duì)C3G進(jìn)行酯交換反應(yīng)，對(duì)?；a(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，并通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，為C3G的?；揎椉昂罄m(xù)的活性研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

矢車菊素-3-葡萄糖苷（HPLC≥98%）購(gòu)自于四川省維克奇生物科技有限公司；固定化脂肪酶Lipozyme 435，購(gòu)于諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；肉豆蔻酸甲酯為分析純，購(gòu)于上海麥克林；叔戊醇、叔丁醇、吡啶、乙腈、異辛烷、正己烷、石油醚等均為分析純，購(gòu)于上海阿拉丁。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

CPA224S分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；Centrifuge 5424R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf公司；ZNCL-GS智能磁力攪拌器，愛(ài)博特科技有限公司；DU-730紫外-分光光度儀，Beckman Coulter公司；Waters 1525高效液相色譜儀，德祥科技有限公司；maXis Impact TOF-MS，美國(guó)布魯克-道爾頓公司；1290 Infinity UHPLC，Agilent公司；1260 Infinity半制備高效液相，Aglient公司；Avanve III HD 600M超導(dǎo)核磁共振波譜儀，美國(guó)布魯克-道爾頓公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單一溶劑中C3G的酰基化反應(yīng)

將反應(yīng)用的磁力攪拌子及玻璃器皿在60 ℃烘箱中預(yù)先干燥24 h，將底物放置于干燥器中保持4 d以上，固定化脂肪酶與C3G放置于4 ℃冰箱保存。在2 mL的棕色血清瓶中加入1 mg C3G，以C3G/?；w摩爾比為1:150加入肉豆蔻酸甲酯，分別加入乙腈、吡啶、叔戊醇、叔丁醇使反應(yīng)液總體積為1 mL，并加入Novezym 435酶（20 mg/mL），攪拌子。將棕色血清瓶放置于磁力攪拌鍋中，以300 r/min的搖動(dòng)速度、60 ℃下反應(yīng)24 h。完成反應(yīng)后，用離心管收集反應(yīng)體系，于4 ℃，12000 r/min的條件下離心7 min，最后通過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾除去脂肪酶和多余底物以終止反應(yīng)。

1.2.2 混合溶劑中C3G的?；磻?yīng)

按照1.2.1的方法，采用C3G與肉豆蔻酸甲酯的比例1:150，Lipozyme 435脂肪酶用量20 mg，反應(yīng)溫度60 ℃，反應(yīng)時(shí)間24 h，以叔戊醇為主要反應(yīng)溶劑，于體系中分別加入20%體積分?jǐn)?shù)的異辛烷、石油醚、吡啶和正己烷進(jìn)行反應(yīng)。

1.2.3 混合溶劑的比例對(duì)?；磻?yīng)的影響

按照1.2.2的方法，以叔戊醇為主要反應(yīng)溶劑，于體系中分別加入20%、40%、60%、80%、100%體積分?jǐn)?shù)的吡啶進(jìn)行反應(yīng)。

1.2.4 反應(yīng)轉(zhuǎn)化率和相對(duì)含量的測(cè)定

采用高效液相法測(cè)定C3G?；a(chǎn)物的生成，并通過(guò)峰面積進(jìn)行轉(zhuǎn)化率及相對(duì)含量的計(jì)算。高效液相色譜以0.1%三氟乙酸水作為流動(dòng)相A，甲醇作為流動(dòng)相B，按1 mL/min的流速進(jìn)行洗脫，通過(guò)PDA檢測(cè)器在雙波長(zhǎng)（280 nm和520 nm）下監(jiān)測(cè)峰。流動(dòng)相的洗脫程序如下：0～5 min，5～10% B；5～10 min，10%B；10～17 min，10～24% B；17～27 min，24～90% B；27～30 min，90% B；30～35 min，90～5% B；35～45 min，5% B。樣品進(jìn)樣量為5 μL，分析柱Waters Xbridge C18（4.6×250 mm，5 μm），柱溫保持在30 ℃。酰基化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率由峰面積比進(jìn)行計(jì)算：

式中：T為C3G?；磻?yīng)的轉(zhuǎn)化率（%），A0為反應(yīng)前液相色譜圖中C3G的峰面積，A1為反應(yīng)后液相色譜圖中C3G的峰面積。

因轉(zhuǎn)化率無(wú)法直觀地表達(dá)C3G衍生物的得率，而通過(guò)高效液相外標(biāo)法測(cè)定衍生物的得率需消耗一定量的C3G衍生物，故定義花色苷衍生物相對(duì)含量來(lái)比較不同?；磻?yīng)條件下產(chǎn)物的得率。相對(duì)含量用以下公式計(jì)算：

式中：Cx為C3G酰基化衍生物的相對(duì)含量；Ax為需計(jì)算的C3G衍生物的峰面積；Amax為單因素條件下C3G衍生物的最大峰面積。

1.2.5 C3G?；苌锏囊合噘|(zhì)譜聯(lián)用分析

采用Agilent 1290 Infinity超高液相色譜儀和maXis Impact TOF-MS高分辨率質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行初步的結(jié)構(gòu)分析。

超高液相色譜測(cè)試條件：色譜柱為ZORBAX RRHD SB-C18 column (2.1 × 50 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相A為0.1%三氟乙酸水，B為甲醇；以0.2 mL/min的流速進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序如下：0～1 min，5% B；1～4 min，5～95% B；4～12 min，95% B；12～13.5 min，95～5% B；13.5～15 min，5% B。進(jìn)樣量1 μL，柱溫保持在30 ℃，測(cè)定波長(zhǎng)設(shè)置在520 nm。

質(zhì)譜條件：使用ESI離子發(fā)射源；正離子模式；掃描范圍：50～1000m/z；毛細(xì)管電壓3.5 kV；干燥氣體為氮?dú)?；干燥氣溫度?80 ℃，流速4.0 L/min；霧化氣壓0.2 bar。

1.2.6 半制備液相色譜對(duì)?；a(chǎn)物進(jìn)行分離提純

以正己烷/甲醇體積比5:2反復(fù)萃取反應(yīng)體系中多余的脂肪酸甲酯后，用Aglient 1260 Infinity半制備高效液相系統(tǒng)進(jìn)一步分離純化肉豆蔻酰C3G。半制備液相條件為：色譜柱：SunFire C18 OBDTM半制備柱（250×19 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為0.1%三氟乙酸水，B為甲醇；PDA檢測(cè)器在雙波長(zhǎng)（280 nm和520 nm）下監(jiān)測(cè)峰；以5 mL/min的流速進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序如下：0～12 min，30% B；12～18 min，30～90% B；18～33 min，90% B；33～36 min，90～30% B。進(jìn)樣量為1.0 mL，柱溫保持在30 ℃。用高效液相方法確定所收集的?；a(chǎn)物的純度。

1.2.7 C3G?；苌锏暮舜殴舱穹治?/p>

C3G的肉豆蔻酸甲酯?；苌锏慕Y(jié)構(gòu)通過(guò)Bruker Avanve III HD 600超導(dǎo)核磁共振波譜儀進(jìn)行進(jìn)一步的探究。將?；a(chǎn)物溶解于氘代甲醇中，采用600 MHz掃描，測(cè)定產(chǎn)物的氫譜（1H-NMR）和碳譜（13C-NMR）。

1.2.8 單因素實(shí)驗(yàn)

按照1.2.2的方法，在20%的吡啶-叔戊醇溶劑中，分別考察反應(yīng)溫度（50、55、60、65 ℃）、C3G與肉豆蔻酸甲酯的摩爾比（1:100、1:150、1:200、1:250）、Lipozyme 435脂肪酶用量（10、20、30、40、50 mg）、反應(yīng)時(shí)間（12、18、24、36、48 h）對(duì)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率和?；苌锏南鄬?duì)含量的影響。

1.2.9 正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)值，選取溫度、時(shí)間、底物比例為考察因素，按L9(34)正交表設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。

1.2.10 數(shù)據(jù)分析與處理

采用Origin 8.0軟件進(jìn)行繪圖，采用SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都是通過(guò)三次平行操作后獲得，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 單一有機(jī)溶劑對(duì)?；磻?yīng)的影響

用固定化脂肪酶Lipozyme 435為生物催化劑，以肉豆蔻酸甲酯為?；w，分別在乙腈、吡啶、叔戊醇、叔丁醇中對(duì)C3G進(jìn)行酰基化修飾，結(jié)果如圖1所示。C3G在乙腈中獲得最高的轉(zhuǎn)化率（69.32%），這是基于已溶解于乙腈中的C3G的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率，然而C3G在乙腈中溶解度低且大多數(shù)發(fā)生沉淀而未進(jìn)行酯交換反應(yīng)。C3G在吡啶中未觀察到?；a(chǎn)物，在叔戊醇和叔丁醇中的轉(zhuǎn)化率分別為10.13%和12.76%。盡管C3G在叔丁醇中的轉(zhuǎn)化率高于叔戊醇，但由于其熔點(diǎn)為25.7 ℃，在室溫下容易結(jié)晶析出，增加了操作難度。因此，具有良好底物溶解性和低熔點(diǎn)的叔戊醇是C3G酰化反應(yīng)的最理想反應(yīng)介質(zhì)。

反應(yīng)介質(zhì)會(huì)影響底物溶解度，酶的特異性、對(duì)映選擇性和區(qū)域選擇性等，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生重要的影響[22]。Feng等[23]用CALB對(duì)油酰酯進(jìn)行?；?，綜合考慮酶的活性和底物溶解度，發(fā)現(xiàn)叔戊醇是最佳的反應(yīng)介質(zhì)。Yang等[24]觀察到C3G的轉(zhuǎn)化率與其在反應(yīng)介質(zhì)中的溶解度呈正相關(guān)，在所有測(cè)試的有機(jī)介質(zhì)中，叔丁醇的轉(zhuǎn)化率最高。用Novozyme 435催化蘆丁、柚皮苷與脂肪酸的?；磻?yīng)也觀察到相同的結(jié)果[25]。但是閆征等[26]用Novozyme 435催化C3G與芳香酸的?；磻?yīng)，發(fā)現(xiàn)酯化反應(yīng)在吡啶中的轉(zhuǎn)化率比叔丁醇和叔戊醇高，反應(yīng)結(jié)果的差異性可能與底物的溶解性和操作條件相關(guān)。

圖1 不同反應(yīng)介質(zhì)對(duì)?；磻?yīng)的影響Fig.1 Effect of different reaction media on the acylation reaction efficiency

2.2 混合反應(yīng)介質(zhì)對(duì)?；磻?yīng)的影響

在叔戊醇中分別添加20%的吡啶、石油醚、正己烷、異辛烷，研究C3G在混合溶劑中的?；磻?yīng)。由圖2a和表1可以看出，添加20%的吡啶、石油醚、正己烷、異辛烷后的?；D(zhuǎn)化率從原來(lái)的10.13%分別提高到15.62%、17.22%、18.66%、18.96%，相比于純叔戊醇溶劑體系均顯著提高，并且轉(zhuǎn)化率隨著混合溶劑體系logP值的增大而增大。說(shuō)明疏水性有機(jī)溶劑的加入，確實(shí)能在一定程度上保護(hù)酶的催化活性提高反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率。由?；a(chǎn)物的相對(duì)含量可以看出，除了20%吡啶-叔戊醇混合溶劑外，?；a(chǎn)物的含量并沒(méi)有隨著轉(zhuǎn)化率的提高而提高，說(shuō)明疏水性溶劑的添加除了對(duì)體系中的酶活性產(chǎn)生影響，還能與底物或反應(yīng)產(chǎn)物相互作用，從而影響酶促反應(yīng)的進(jìn)行[27]。20%（V/V）吡啶的加入雖然降低了溶劑體系的logP值，但是轉(zhuǎn)化率相比純的叔戊醇溶劑仍有顯著上升（p＜0.05），這表明極性可能不是影響酶活性的唯一因素。每種有機(jī)溶劑都有其特定的分子結(jié)構(gòu)，并與酶分子發(fā)生獨(dú)特的干擾或者結(jié)合，從而導(dǎo)致生物催化劑的活性不同[19]。反應(yīng)產(chǎn)生的?；苌锖吭?0%吡啶-叔戊醇溶劑體系中也相對(duì)較高，可能原因是矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和肉豆蔻酸甲酯在吡啶中的溶解度較高[28]。綜合考慮反應(yīng)轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的相對(duì)含量，選擇20%吡啶-叔戊醇溶劑進(jìn)行反應(yīng)。

圖2 混合溶劑對(duì)?；磻?yīng)的影響Fig.2 Effect of mixed solvent on acylation efficiency

由圖2b、表1可以看出，隨著吡啶添加比例的增加，轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在20%的吡啶添加比例下獲得最高的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物相對(duì)含量。一定比例吡啶的添加可以增加底物溶解性，從而提高?；磻?yīng)的轉(zhuǎn)化率及得率，隨著吡啶比例的增加，混合溶劑的極性增加，logP值由1.15降至0.71，導(dǎo)致酶活性減弱，?；D(zhuǎn)化率從15.62%降至0%。因此選擇20%吡啶-叔戊醇溶劑作為最佳體積配比的混合溶劑。

自Mutua等[29]在研究脂肪酶促糖酯合成中首次采用了混合溶劑后，已有較多生物催化在混合有機(jī)溶劑中進(jìn)行并獲得令人滿意的結(jié)果。Ferrer等[30]采用脂肪酶催化合成月桂酰蔗糖時(shí)，在叔丁醇中加入10%的DMSO溶劑后使得反應(yīng)轉(zhuǎn)化率由35%增加到70%。Feng等[19]用施氏假單胞菌催化葡萄糖酯的合成時(shí)，在吡啶中加入25%的異辛烷后，酯交換轉(zhuǎn)化率由原來(lái)的77.9%提高到96.7%。

表1 混合溶劑對(duì)?；磻?yīng)的影響Table 1 Effect of mixed solvent on acylation efficiency

2.3 酰基化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

圖3 液相及質(zhì)譜圖Fig.3 The liquid phase spectra and mass spectra

采用HPLC檢測(cè)產(chǎn)物的生成，用HPLC-MS/MS和NMR對(duì)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。如圖3所示，反應(yīng)體系在520 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)到兩個(gè)色譜峰。經(jīng)HPLC-MS/MS測(cè)定，14.83 min處的峰相對(duì)分子量為449.11，與C3G的相對(duì)分子量一致。21.19 min處峰對(duì)應(yīng)的分子離子峰[M+H]為659.31，恰好跟一個(gè)C3G與一個(gè)肉豆蔻酸甲酯脫掉一份子水后的相對(duì)分子量一致，說(shuō)明?；磻?yīng)只生成了單?；a(chǎn)物。?；a(chǎn)物的二級(jí)質(zhì)譜只檢測(cè)到了相對(duì)分子量為287.06的離子碎片，與矢車菊素的相對(duì)分子質(zhì)量一致，說(shuō)明該酰基化反應(yīng)發(fā)生于葡萄糖的羥基上，而非糖苷配體的任何羥基上。

圖4 C3G與肉豆蔻酰C3G的1H-NMR譜圖Fig.4 1H NMR spectrum of C3G and myristoyl C3G

圖5 C3G與肉豆蔻酰C3G的13C-NMR譜圖Fig.5 13C NMR spectrum of C3G and myristoyl C3G

通過(guò)半制備高效液相分離純化得到純度接近于100%的C3G?；a(chǎn)物，用NMR進(jìn)行氫譜（1H-NMR）和碳譜（13C-NMR）分析，結(jié)果如圖4、5所示。C3G?；磻?yīng)導(dǎo)致C-6″位置的C化學(xué)位移達(dá)3.97×10-6（60.91×10-6～64.88×10-6），而其他位置C的化學(xué)位移相差2×10-6以內(nèi)。H-6A″與H-6B″位置的H的化學(xué)位移差值也分別達(dá)到0.59×10-6（3.96×10-6～4.55×10-6）、0.48×10-6（3.91×10-6～4.39×10-6），這表明酰基化反應(yīng)很有可能發(fā)生在C3G葡萄糖苷部分的C-6''上，C3G的肉豆蔻酸單?；苌锉昏b定為矢車菊素-3-(6″-肉豆蔻酰)-葡萄糖苷。

De Oliveira等用CALB脂肪酶對(duì)類黃酮進(jìn)行?；磻?yīng)，研究發(fā)現(xiàn)類黃酮的糖苷配基部分可以通過(guò)類黃酮酚基與疏水殘基的主鏈羰基之間的氫鍵相互作用以及酚基與Ala，Ile，Leu和Val殘基的側(cè)鏈之間的氫鍵相互作用而相對(duì)穩(wěn)定[31]。類黃酮的糖苷部分具有一塊較小的極性區(qū)域，是唯一可以讓催化底物接近的羥基。CALB催化花色苷的酰基化反應(yīng)通常生成單?；苌?，并且反應(yīng)通常發(fā)生在糖苷部分的伯羥基上[24]。這種嚴(yán)格的區(qū)域選擇性與之前的研究結(jié)果一致[16,26]。

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

2.4.1 反應(yīng)溫度對(duì)酰基化反應(yīng)的影響

圖6 溫度對(duì)?；磻?yīng)的影響Fig.6 Effect of temperature on acylation efficiency

溫度會(huì)影響C3G的穩(wěn)定性及溶解性，并影響酶的催化活性及穩(wěn)定性，是酶催化反應(yīng)的一個(gè)重要因素[32]。Lipozyme 435是一種耐熱性較高的脂肪酶，隨著溫度的升高其活性會(huì)越來(lái)越強(qiáng)，但溫度高達(dá)一定程度后，酶容易受熱變性造成活力下降。分別在50、55、60和65 ℃溫度下催化C3G的?；磻?yīng)。由圖6可以看出，?；磻?yīng)的轉(zhuǎn)化率隨著溫度的升高而顯著增加（p＜0.05），由13.20%最終提高到24.17%。這是由于隨著反應(yīng)溫度的提高，Lipozyme 435酶的活性越來(lái)越強(qiáng)，且底物的溶解度增強(qiáng)，反應(yīng)體系中傳質(zhì)速度加快導(dǎo)致底物相互接觸的機(jī)會(huì)增多的原因[28]。但是酰基化產(chǎn)物的相對(duì)含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)溫度低于55 ℃時(shí)，酰基化產(chǎn)物的相對(duì)含量隨著轉(zhuǎn)化率的增加而增加，但當(dāng)溫度超過(guò)55 ℃之后，長(zhǎng)時(shí)間的熱處理致使C3G及其反應(yīng)產(chǎn)物發(fā)生降解，導(dǎo)致?；a(chǎn)物的相對(duì)含量減少。因此，選取55 ℃為此單因素實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)條件。

2.4.2 底物摩爾比對(duì)酰基化反應(yīng)的影響

圖7 底物摩爾比?；磻?yīng)的影響Fig.7 Effect of molar ratio of C3G to methyl myristate on acylation efficiency

增加?；w的含量有利于底物與脂肪酶、底物之間的碰撞，提高反應(yīng)轉(zhuǎn)化率。分別以C3G與?；w的摩爾比1:100、1:150、1:200、1:250進(jìn)行?；磻?yīng)。由圖7可以看出，隨著肉豆蔻酸甲酯添加量的增加，C3G的轉(zhuǎn)化率隨之升高，由10.24%最終提高到21.15%，且各組數(shù)據(jù)之間存在顯著性差異（p＜0.05），?；a(chǎn)物的相對(duì)含量也顯示出了相同的趨勢(shì)。肉豆蔻酸甲酯的凝固點(diǎn)較高，添加過(guò)多的肉豆蔻酸甲酯會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)后的體系在常溫下凝固，不利于后續(xù)?；a(chǎn)物的分離純化，故選取底物摩爾比1:200作為此單因素實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)條件。

2.4.3 酶的添加量對(duì)?；磻?yīng)的影響

圖8 酶的添加量對(duì)酰基化反應(yīng)的影響Fig.8 Effect of f enzyme usage level on acylation efficiency

酶的添加量也是影響酶催化反應(yīng)的重要因素。酶的添加量過(guò)小無(wú)法催化C3G與肉豆蔻酸甲酯的充分反應(yīng)，酶的添加量過(guò)大又不利于節(jié)約成本。分別添加10、20、30、40 mg的Lipozyme 435脂肪酶催化?；磻?yīng)的進(jìn)行。如圖8所示，隨著體系中脂肪酶添加量的增加，C3G的轉(zhuǎn)化率呈上升的趨勢(shì)。當(dāng)酶的添加量從10 mg增加為20 mg時(shí)，其轉(zhuǎn)化率從15.45%增加到17.10%，表現(xiàn)出明顯差異（p＜0.05），當(dāng)酶的添加量進(jìn)一步增加后，其轉(zhuǎn)化率并沒(méi)有呈現(xiàn)出顯著差異，這是由于酶的量與底物濃度接近“飽和”，無(wú)法進(jìn)一步有效得提高轉(zhuǎn)化率。?；a(chǎn)物的相對(duì)含量也呈現(xiàn)出相同趨勢(shì)。結(jié)合轉(zhuǎn)化率和衍生物的相對(duì)含量，同時(shí)考慮經(jīng)濟(jì)成本，選用20 mg酶用量作為此單因素實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)條件。

2.4.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酰基化反應(yīng)的影響

圖9 反應(yīng)時(shí)間對(duì)?；磻?yīng)的影響Fig.9 Effect of reaction time on acylation efficiency

?；磻?yīng)分別進(jìn)行12、18、24、36、48 h后測(cè)其轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物相對(duì)含量。結(jié)果見(jiàn)圖9所示，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，轉(zhuǎn)化率沒(méi)有呈現(xiàn)出明顯的規(guī)律。?；a(chǎn)物的相對(duì)含量隨著反應(yīng)時(shí)間的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，前期的上升是由于?；磻?yīng)的進(jìn)行導(dǎo)致?；苌锏姆e累，反應(yīng)進(jìn)行18 h之后C3G及其?；苌镉捎陂L(zhǎng)時(shí)間維持在較高溫度下分解導(dǎo)致含量的減少。因此，選取反應(yīng)時(shí)間18 h為此單因素的最優(yōu)條件。

2.5 正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取反應(yīng)溫度（A）、反應(yīng)時(shí)間（B）、底物摩爾比（C）三個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，每個(gè)因素選取三個(gè)水平進(jìn)行分析，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行極差分析來(lái)確定最佳反應(yīng)條件。采用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

由極差分析結(jié)果可以看出，三個(gè)因素對(duì)C3G酰基化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響大小順序?yàn)榈孜锬柋龋緶囟龋緯r(shí)間。分析各因素的K值，可以得出最優(yōu)反應(yīng)條件為：溫度60 ℃、反應(yīng)時(shí)間22 h、底物摩爾比1:250。對(duì)上述反應(yīng)條件進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，得到的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為33.25%，比單因素實(shí)驗(yàn)得出的最優(yōu)轉(zhuǎn)化率結(jié)果高出10.63%。

表2 正交試驗(yàn)因素水平及結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental design and results

3 結(jié)論

本研究用固定化脂肪酶Lipozyme 435為生物催化劑，以肉豆蔻酸甲酯為?；w對(duì)C3G進(jìn)行?；揎?，分別在單一有機(jī)溶劑和混合有機(jī)溶劑中進(jìn)行該反應(yīng)，得出在混合溶劑體系中的C3G?；磻?yīng)的轉(zhuǎn)化率均比單一溶劑顯著提高（p＜0.05），20%吡啶-叔戊醇作為最佳反應(yīng)介質(zhì)使?；D(zhuǎn)化率由10.13%提高到15.62%。對(duì)?；a(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，發(fā)現(xiàn)?；磻?yīng)很有可能發(fā)生于C3G的6″-OH上。最后以20%吡啶-叔戊醇為反應(yīng)介質(zhì)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化合成條件，獲得肉豆蔻酰C3G的最優(yōu)合成條件：溫度60 ℃、反應(yīng)時(shí)間22 h、C3G/肉豆蔻酸甲酯摩爾比1:250、酶的添加濃度20 mg/mL，在該條件下以肉豆蔻酸甲酯為?；w對(duì)C3G進(jìn)行?；揎棲@得了33.25%的轉(zhuǎn)化率。后續(xù)可以通過(guò)HMBC等技術(shù)進(jìn)一步確證肉豆蔻酰C3G的結(jié)構(gòu)，并嘗試在離子液體中進(jìn)行C3G的?；揎棧沟悯；磻?yīng)更加環(huán)保。