徐儷菲，王宇

(錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121000)

惡性腫瘤是21世紀(jì)全球范圍內(nèi)最常見的疾病之一，隨著癌癥患者死亡率的不斷增加，已經(jīng)嚴(yán)重?fù)p害了人類的健康[1-2]。癌癥的發(fā)生、發(fā)展是一個復(fù)雜的多階段過。在臨床實踐中，包括手術(shù)切除、放射治療、化學(xué)治療、激素治療等傳統(tǒng)的癌癥治療方式取得了一定的療效[3]，但癌癥患者5年生存率低。研究表明[4]，如果能早期發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤，其5年生存率可高達(dá)90%。因此，癌癥的早期診斷對癌癥患者的臨床治療至關(guān)重要。

研究表明[5]，多種細(xì)胞因子參與癌癥的增殖、凋亡、侵襲等生理變化過程。細(xì)胞因子是細(xì)胞在各種刺激下分泌的小分子，通過與靶細(xì)胞上的特定受體結(jié)合參與生物學(xué)過程。相關(guān)研究證明[6]，細(xì)胞因子分泌的炎癥因子不僅可以直接損傷腫瘤細(xì)胞，而且在激活單核細(xì)胞殺滅腫瘤細(xì)胞中起著關(guān)鍵作用。例如，在肝癌患者中，引發(fā)肝臟損害的因素主要是Th1型炎癥細(xì)胞中的IP-10和趨化因子配體5(chemokine igand 5，RANTES)細(xì)胞因子。它們不僅能高效活化淋巴細(xì)胞，并能發(fā)揮識別、滲入和黏附炎癥部位的功能。因此，IP-10和RANTES可以直接參與機(jī)體的免疫應(yīng)答過程，還可以有效發(fā)揮其抗病毒和聚集淋巴細(xì)胞的重要作用[7]。白介素和趨化因子作為促炎因子，在許多免疫性疾病和炎癥反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用，它們也與腫瘤密切相關(guān)。鑒于發(fā)現(xiàn)白介素和趨化因子在多種惡性腫瘤表達(dá)中均有不同程度的差異，因此，檢測其在血清或者組織中的表達(dá)情況對惡性腫瘤的臨床診斷具有重要參考價值。本研究通過構(gòu)建荷瘤小鼠模型檢測IL -2，IL -6 和IP-10等細(xì)胞因子在常見惡性腫瘤中的表達(dá)水平，為癌癥的預(yù)防和診斷提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

SPF級6～8周齡的BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠購買自北京維通利華公司，飼養(yǎng)于實驗動物中心。DMEM培養(yǎng)基、1%青、鏈霉素和胎牛血清、0.25%胰酶消化液購于美國Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%FBS和1%青、鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1.2.2 荷瘤動物模型

取對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶消化后，用PBS清洗并計數(shù)，重懸后備用。將各系腫瘤細(xì)胞懸液皮下接種于實驗組小鼠背側(cè)皮膚，其中MC-38組細(xì)胞數(shù)為1×105、B16組細(xì)胞數(shù)為1×105、E0771組細(xì)胞數(shù)為1×106、Hepa1-6組細(xì)胞數(shù)為1×107、4T1組細(xì)胞數(shù)為2×106。觀察30 d后通過小鼠眼球取血，離心后取上層血清。對照組小鼠不做任何處理后，直接通過小鼠眼球取血，在相同條件下，離心后取上層小鼠血清。解剖分離所有荷瘤小鼠的腫瘤并稱量，繪制相關(guān)曲線。

1.2.3 Luminex細(xì)胞因子檢測

Luminex 200系統(tǒng)用于測量血清樣品的細(xì)胞因子表達(dá)水平，包括腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白細(xì)胞介素1α(interleukin-1α，IL-1α)、白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)、白細(xì)胞介素8(interleukin-8，IL-8)、白細(xì)胞介素10(interleukin-10，IL-10)、白細(xì)胞介素15(interleukin-15，IL-15)、白細(xì)胞介素1(interleukin-13，IL-13)、干擾素γ (interferon γ，IFN-γ)等。使用Luminex200 IS V2.1軟件從平均熒光強(qiáng)度獲得濃度值，標(biāo)準(zhǔn)曲線由參考細(xì)胞因子梯度濃度生成，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中這些細(xì)胞因子的濃度。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 小鼠血清中各型細(xì)胞因子水平的檢測結(jié)果

TNF-α，IL-1α，IL-1β，IL-6，IL-8，IL-10，IL-15，IL-13，IFN-γ在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在MC-38組中，IL-2、白細(xì)胞介素9(interleukin-9，IL-9)、趨化因子巨噬細(xì)胞炎性蛋白MIP-1(MIP-1α和MIP-1β)，IP-10表達(dá)最高(P<0.001)，見圖1A。此外，還觀察到B16組MIP-1α、IL-6高于正常對照組的趨勢持續(xù)存在，見圖1B。E0771組與正常組相比，IL-2、MIP-2有顯著性差異(P<0.01)，見圖1C。MIP-1的濃度結(jié)果顯示，Hepa1-6組均高于正常組(P<0.05)，見圖1D。對于IL-2的水平，4T1組明顯高于正常組(P<0.05)，見圖1E。值得注意的是，在MC-38，E0771，Hepa1-6，4T1組之間也發(fā)現(xiàn)了IL-2水平的顯著差異。與正常組相比，B16組IL-6濃度較高(P<0.01)，而MC-38組IL-6濃度差異明顯低于B16組。各組間IFN-γ濃度無顯著差異。對于趨化因子IP-10來說，Hepa1-6組的濃度低于正常對照組；MC-38，B16，4T1組水平則高于正常組。

A代表MC-38組血清中細(xì)胞因子表達(dá)譜；B代表B16組血清中細(xì)胞因子表達(dá)譜；C代表E0771組血清中細(xì)胞因子表達(dá)譜；D代表HEPA1-6組血清中細(xì)胞因子表達(dá)譜；E代表4T1組血清中細(xì)胞因子表達(dá)譜(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n=15)

2.2 對照組與荷瘤小鼠血清中各型細(xì)胞因子水平

對照組和荷瘤實驗組血清中相關(guān)幾種細(xì)胞因子(G-CSF、IL-2、IL-4、IL-9IL-6、IL-10、IP-10、MIP-1β、TNF- α、IFN- γ、IL-6)水平。與對照組比較，4T1組荷瘤小鼠血清中G-CSF、IL-2、IL-4、IP-10 、TNF- α水平明顯升高(P<0.05)，見表1。而MC-38組血清中，IL-2、IL-9、MIP-1β、IP-10有明顯差異(P<0.001)，見表2。與正常組相比，B16組IL-6、Eotaxin濃度較高(P<0.01)，見表3。E0771組中，TNF-α水平則無顯著差異，見表4。Hepa1-6組中，IL-2的水平與對照組相比，仍然有顯著差異(P<0.01)，見表5。

2.3 腫瘤重量與細(xì)胞因子相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析顯示，MC-38組中，IP-10、MCP-1、RANTES與腫瘤重量均呈正相關(guān)，E0771組中，IL-9與腫瘤重量呈正相關(guān)，見圖2。

表1 對照組和4T1組血清中細(xì)胞因子水平

表2 對照組和MC-38組血清中細(xì)胞因子水平

表3 對照組和B16組血清中細(xì)胞因子水平

組別G-CSFEotaxinIL-2IL-4IL-9IL-10IP-10MIP-1βMIP-2TNF-αIFN-γIL-6E0771組48.5±38.4517.8±237.75.1±4.14.3±0.96.4±7.8601±1627.7±2.9113±80.44.5±2.82.1±0.33±1.413.1±4.9對照組519±2201415±6482.7±0.51±0.8410±1255.7±11.5204±566.7±5.3105±11.88±82.2±1.58.5±8.4t值0.1012.3231.1675.7941.7027.1542.0000.2260.1802.0000.8431.598P0.9010.0650.2230.1000.110<0.0010.8300.9670.9230.0700.4230.146

A

C

D

3 討 論

癌癥是全球死亡的主要原因之一。迄今為止，超過1600萬人被診斷患有癌癥。由于腫瘤發(fā)病隱匿及初期癥狀不明顯，腫瘤患者被確診時多處于中晚期，臨床治療效果差而導(dǎo)致惡性腫瘤患者的術(shù)后生存率低[8]。為了提高全民健康水平，亟需對癌癥進(jìn)行早期診斷和治療。

細(xì)胞因子是由外界刺激炎性細(xì)胞而合成分泌的一類具有多種功能的小分子蛋白質(zhì)，作為細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，主要參與免疫細(xì)胞分化發(fā)育、介導(dǎo)免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)等?，F(xiàn)如今細(xì)胞因子在各種疾病中的表達(dá)也有很多報道[9]?，F(xiàn)有研究中酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)等常用檢測方法大多以單一因子檢測為主，且檢測的細(xì)胞因子種類也較少。本研究采用Luminex檢測荷瘤小鼠血清中的細(xì)胞因子，我們發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，血清中的IL-2，IL-6，IP-10的表達(dá)量在多種腫瘤細(xì)胞中都具有顯著差異。臨床上，IL-2，IL-12和IL-15已經(jīng)在小鼠癌癥模型中顯示了療效，并且大劑量IL-2已經(jīng)用于治療轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤，表明這些血清標(biāo)志物對癌癥具有一定的診斷價值[10]。然而，單一的細(xì)胞因子療法并沒有達(dá)到小鼠模型試驗中所看到的效果，所以，我們的目的是利用多參數(shù)聯(lián)合分析細(xì)胞因子來提高診斷的敏感性和特異性。

炎癥被認(rèn)為是癌癥進(jìn)展的危險因素。在這個過程中，活化的吞噬細(xì)胞分泌大量的促炎細(xì)胞因子，如IL-6、IL-8、TNF-α等。這些促炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平在炎癥反應(yīng)性疾病中顯著增加。有關(guān)血液中細(xì)胞因子的表達(dá)譜檢測在腫瘤中也有很多報道[11]。故本研究從細(xì)胞因子表達(dá)譜著手，觀察荷瘤小鼠及野生型小鼠相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的情況，并對上述模型的特征進(jìn)行初步探究。實驗結(jié)果顯示，荷瘤各組小鼠均出現(xiàn)了血清細(xì)胞因子表達(dá)譜的差異。與正常組比較，MC-38、B16組IL-6、TNF-α水平明顯升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義。大量文獻(xiàn)表明[12]，IL-6在許多腫瘤組織和周圍血管中活躍，引起各種細(xì)胞因子的分泌增加。它不僅能直接刺激單核-巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分泌IL-6，而且其在自身生長過程中也能分泌大量IL-1α促進(jìn)惡性細(xì)胞增殖。IL-6及其受體的失衡影響了整個微環(huán)境的穩(wěn)定性，導(dǎo)致免疫功能紊亂，從而誘發(fā)腫瘤。TNF-α是由巨噬細(xì)胞和活化的T細(xì)胞產(chǎn)生的多功能細(xì)胞因子，它參與誘導(dǎo)急性白蛋白反應(yīng)，并通過激活中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞來調(diào)節(jié)代謝活動。我們發(fā)現(xiàn)，趨化因子家族在腫瘤微環(huán)境中的研究也逐漸受到重視。趨化因子本身能夠與血管內(nèi)皮細(xì)胞相結(jié)合，具有激活并趨化白細(xì)胞移動的作用。IP-10是一種由I型和II型干擾素誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞靶向CXC趨化因子，它由腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞及富含干擾素和細(xì)胞因子的腫瘤細(xì)胞和實質(zhì)細(xì)胞分泌，并且在炎癥條件下對淋巴細(xì)胞的募集起重要作用[13]。

在本研究中，雖證實抗炎性細(xì)胞因子、趨化因子及促炎性細(xì)胞因子與腫瘤的發(fā)生有著密切的關(guān)系，然而，前期我們只做了基礎(chǔ)性研究，之后其中一個主要問題是在動物模型中，我們將討論上述基因參與促進(jìn)腫瘤發(fā)育的機(jī)制。利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建這些基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)模型，從而依據(jù)模型來預(yù)測潛在的靶向基因有IL18、foxp3等。利用生物信息學(xué)分析確定了差異表達(dá)的基因，它們可能與癌癥的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后相關(guān)，并對發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)基因，進(jìn)行RNA測序，探尋其調(diào)控腫瘤發(fā)生、發(fā)展的信號通路[14]。然而，這些我們還沒有后續(xù)的實驗驗證，還有許多困難需要克服，需要對其調(diào)控機(jī)制進(jìn)一步研究。

綜上所述，抗炎性細(xì)胞因子、趨化因子及促炎性細(xì)胞因子等細(xì)胞因子形成了錯綜復(fù)雜的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而影響臨床癌癥治療。闡明這些細(xì)胞因子的變化和作用，對于研究腫瘤的發(fā)生及發(fā)展機(jī)制具有重要意義，進(jìn)而為臨床腫瘤早期診斷及治療提供新的理論基礎(chǔ)。