肖旭陽，杜天宇，周玄，王立坤

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

肺癌是臨床上常見的一種原發(fā)性惡性腫瘤，起源于氣管、支氣管粘膜或腺體，根據(jù)組織病理學(xué)特點(diǎn)不同，可分為非小細(xì)胞肺癌與小細(xì)胞癌，其中非小細(xì)胞肺癌最為常見，占總發(fā)病率的85%以上，不具有傳染性，但遺傳性、家族聚集性較強(qiáng)，處于臨床I期的患者其5年生存率僅有60%～70%，發(fā)病率、死亡率較高，在女性人群中，死亡率位列第二，是全球癌癥死亡的主要原因之一，早期癥狀不明顯，進(jìn)一步的會(huì)發(fā)生惡化與轉(zhuǎn)移，等確診時(shí)，大多數(shù)患者已處于疾病晚期，治療難度較大，給患者的生命健康造成了極大的威脅[1-2]。臨床上常用手術(shù)的方法治療非小細(xì)胞肺癌，可一定程度控制病情發(fā)展，但由于疾病晚期患者，免疫力降低，身體自我保護(hù)機(jī)制搜到損害，削弱了手術(shù)整體效果，而放射治療聯(lián)合化學(xué)治療成為了治療非小細(xì)胞肺癌的有效方法[3-4]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在肺癌細(xì)胞的增殖、疾病的發(fā)展中起著重要作用，激活mTOR信號(hào)通路，可加快細(xì)胞的新陳代謝，與癌癥進(jìn)展有著密切關(guān)系[5-6]?，F(xiàn)階段單一利用雷帕霉素激活mTOR信號(hào)通路方法并不成熟，正處于研究階段，雷帕霉素類藥物有希望成為治療非小細(xì)胞肺癌的首選藥物。本研究探討不同劑量射線作用對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者mTOR信號(hào)通路的影響，具體報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

所用培養(yǎng)液為：RPMI1640，試劑有：谷氨酰胺、氨芐青霉素鈉、硫酸鏈霉素、雷帕霉素，胎牛血清，mTOR、p70S6K、p-4EBPI、β-actin，免疫組織化學(xué)SP試劑盒、二氧基聯(lián)苯胺(DBA)顯色劑，24孔板、96孔板、細(xì)菌培養(yǎng)皿，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞檢測(cè)儀、Annexin V-FITC凋亡試劑盒、ECL發(fā)光試劑盒，X射線感光膠片、定影液、顯影液。其中，ELC發(fā)光試劑盒購自Millipore，X射線感光膠片、定影液和顯影液均購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人非小細(xì)胞肺癌系A(chǔ)549購自ATCC(VA，USA)，使用含10%胎牛清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液，在無菌條件下進(jìn)行培養(yǎng)，溫度設(shè)置為37 ℃，細(xì)胞融合度為80%時(shí)，將經(jīng)胰蛋白酶消化過的細(xì)胞收集起來[7-8]。

1.3 電離輻射

進(jìn)行細(xì)胞種植，融合度≥60時(shí)，清洗培養(yǎng)液，利用Varian-23Ex-1、X-Ray generator進(jìn)行細(xì)胞照射，照射方式為：直線加速器照射(M9-XHA600C)，照射野是10 cm×10 cm，X射線能量：6 MV，劑量分別為2、4、6、8 Gy。

1.4 Wastern Blot檢測(cè)

提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)移后，加入100 mL/L脫脂奶粉，密封1 h，加入1∶200稀釋過的一抗，溫度保持恒溫4 ℃下過夜，加入1∶5000稀釋過的HRP-IgG，室溫孵育60 min，通過化學(xué)發(fā)光試劑曝光顯影，掃描膠片[9-10]。

1.5 細(xì)胞活力檢測(cè)(MTT)

進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)(MTT)，在96孔板中接種細(xì)胞，時(shí)間為1 w，1 w后才有0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液進(jìn)行染色，溶解，使用分光光度計(jì)進(jìn)行吸光度檢測(cè)，利用電腦繪制圖譜[11-12]。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

將細(xì)胞接種于6孔板中，進(jìn)行貼壁處理，加入不同濃度的matrine，在不同的時(shí)間短觀察細(xì)胞生長情況，觀察時(shí)間段為24、48、72 h，然后制作細(xì)胞懸液，檢測(cè)細(xì)胞活性，重復(fù)進(jìn)行3次，減少誤差。

1.7 克隆形成試驗(yàn)

將1×103的非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞接種到含有雷帕霉素的培養(yǎng)基中，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，規(guī)定不同劑量射線照射的時(shí)間、天數(shù)，用甲醇固定細(xì)胞，使用吉姆薩染色，統(tǒng)計(jì)克隆數(shù)量，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 雷帕霉素藥物對(duì)mTOR信號(hào)通路及下游信號(hào)分子的抑制作用

隨著雷帕霉素藥物濃度升高，mTOR、p70S6K、p-4EBPI及AKT表達(dá)降低，β-actin作為內(nèi)參，見圖1。

圖1 雷帕霉素藥物對(duì)mTOR信號(hào)通路及下游信號(hào)分子的抑制作用

2.2 雷帕霉素對(duì)非小細(xì)胞肺癌放療敏感性的影響

觀察組細(xì)胞存活能力低于對(duì)照組(P<0.05)，見圖2。

系列1代表A549，系列2代表A549+雷帕霉素，系列3代表(A549+雷帕霉素)+4 Gy，系列4代表(A549+雷帕霉素)+8 Gy

2.3 雷帕霉素作用下非小細(xì)胞肺癌放療對(duì)細(xì)胞克隆形成能力的抑制作用

將非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549接種于培養(yǎng)皿中(直徑：100 mm)，觀察組用含50 nmol/L的雷帕霉素培養(yǎng)基，對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞分別用劑量為4 Gy、8 Gy的射線照射2 w后，甲醇固定，吉姆薩染色照相，發(fā)現(xiàn)4 Gy觀察組細(xì)胞平均克隆數(shù)目為(56±4)，8 Gy觀察組細(xì)胞平均克隆數(shù)目為(18±3)，低于對(duì)照組(146±23)(P<0.05)。

3 討 論

非小細(xì)胞肺癌作為常見的惡性腫瘤之一，多發(fā)于老年人群，近年來隨著生活方式的改變，發(fā)病人群逐漸年輕化，根據(jù)病理類型可分為腺癌、鱗癌、大細(xì)胞癌、腺鱗癌、唾液腺型腫瘤等，發(fā)病率、死亡率越來越高，細(xì)胞分化發(fā)生異常、增殖不受控制，是肺癌細(xì)胞區(qū)別于正常細(xì)胞的最顯著的兩個(gè)特征，目前常用放療或化療的方法進(jìn)行治療[13-14]。近年來，mTOR通路在肺癌治療中受到了廣泛關(guān)注，當(dāng)PI3K收到受體酪氨酸激酶、Ras、整合素以及各種生長因子等多種因子，被激活時(shí)，可加快磷酸化肌醇誘導(dǎo)3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇及3，4-二磷酸磷脂酰肌醇的生成，被激活的Akt，通過3-磷脂酰肌醇依賴性蛋白激酶1及3-磷脂酰肌醇依賴性蛋白激酶2磷酸化，將信號(hào)傳遞給mTOR，進(jìn)而兩種復(fù)合形態(tài)的mTOR，對(duì)下游的mRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，影響細(xì)胞的新陳代謝速度。另外在腫瘤細(xì)胞中，AKT可通過磷脂酰肌醇3-激酶磷酸化激活caspase9、Bad、FOXO、GSK-3b及IKK等因子促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。同時(shí)，pAKT還可以緩解TSC1/2和Rheb對(duì)mTOR的抑制，而激活的mTOR與RAPTOR結(jié)合后可以通過mTORC1磷酸化激活核糖體S6激酶，干預(yù)5’-TOP結(jié)構(gòu)對(duì)mRNA的翻譯，影響細(xì)胞生長。有研究表明，mTOR信號(hào)通路與肺癌細(xì)胞的增殖關(guān)系密切，可從多種方面加快細(xì)胞癌變，激活mTOR信號(hào)通路，會(huì)加快細(xì)胞的凋亡，且機(jī)體內(nèi)mTOR蛋白水平與肺癌化療效果呈正相關(guān)，抑制該通道，逆轉(zhuǎn)耐藥性，提高化療、放療的效果[15-16]。但目前關(guān)于mTOR信號(hào)通路對(duì)非小細(xì)胞肺癌放療的敏感性報(bào)道較少，本研究在此基礎(chǔ)上展開了研究。

本研究中，觀察組非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞存活能力低于對(duì)照組(P<0.05)，說明mTOR信號(hào)通路對(duì)非小細(xì)胞肺癌放療效果較好。mTOR信號(hào)通路被激活后，可將磷酸化下游靶蛋白p70S6k和p-4EBPI轉(zhuǎn)移，加快細(xì)胞增殖，而通過雷帕霉素對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的抑制作用，降低mTOR蛋白、p70S6k和p-4EBPI的表達(dá)能力，構(gòu)建mTOR信號(hào)通路抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞[17-18]。細(xì)胞凋亡是基因程序化、生命力頑強(qiáng)的細(xì)胞自殺的一個(gè)過程，可調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞平衡，清除多余的細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝，而細(xì)胞在死亡過程中發(fā)生異常，會(huì)減少細(xì)胞的增殖，加快細(xì)胞死亡速度，成了治療非小細(xì)胞肺癌的重要方法之一。自噬可加快細(xì)胞死亡速度，不同劑量射線作用可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞死亡，mTOR通路誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞自噬和凋亡，抑制細(xì)胞增殖，從而起到抑制腫瘤的作用。而血管內(nèi)皮生長因子可選擇性與血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上高親和力的受體硌氨酸激酶結(jié)合，造成受體磷酸化，從而發(fā)生活化，加快內(nèi)皮細(xì)胞遷移，mTOR基因表達(dá)水平作為Akt的下游信號(hào)，受血管內(nèi)皮生長因子影響，可提高診斷靈敏度[19-20]。另外mTOR由mTORC1和mTORC2兩種多蛋白復(fù)合體組成，mTORC1對(duì)雷帕霉素敏感度較高，mTORC2對(duì)雷帕霉素耐受性較強(qiáng)，mTORC1可調(diào)節(jié)細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成及細(xì)胞增殖，當(dāng)mTOR失調(diào)后，將導(dǎo)致癌癥等諸多疾病發(fā)生，而活化后的mTORC1可誘導(dǎo)核糖體S6激酶、真核翻譯啟動(dòng)因子4E，mTORC2參與細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)，控制細(xì)胞的生長、代謝[21]。另外肺癌細(xì)胞在增殖狀態(tài)，會(huì)產(chǎn)生一些放射耐受細(xì)胞，可通過多種細(xì)胞因子、激素及生長因子進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，改變信號(hào)通路，使機(jī)體對(duì)放療產(chǎn)生抗拒，而哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白是AKT信號(hào)通路下游的效應(yīng)分子，可促進(jìn)細(xì)胞周期素的表達(dá)，發(fā)揮AKT的抑制作用，提高對(duì)射線的敏感性，從而提高放療敏感性。

綜上所述，mTOR信號(hào)通路被抑制后，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡速度，加快細(xì)胞新陳代謝能力，提高放療效果，增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌放療敏感性。