嚴(yán)其高，劉金林，余水紅，曹凱，祁冰潔

(安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，安徽 安慶 246052)

血管內(nèi)皮覆蓋于整個(gè)血管腔表面，對(duì)血管具有重要的保護(hù)作用，也構(gòu)成了血管內(nèi)壁和血流之間的屏障。血管內(nèi)皮能夠發(fā)揮重要的內(nèi)分泌功能和信號(hào)傳導(dǎo)功能，是機(jī)體最大的內(nèi)分泌和旁分泌器官[1]。研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮能夠通過(guò)分泌相關(guān)內(nèi)源性因子，參與血管的修復(fù)、收縮、舒張等生理過(guò)程[2]。此外，血管內(nèi)皮可通過(guò)分泌相關(guān)細(xì)胞因子，控制機(jī)體炎癥反應(yīng)、血栓等病理過(guò)程的發(fā)生及發(fā)展[3]。高血壓病理狀態(tài)下，全身細(xì)小動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能均處于失調(diào)狀態(tài)，內(nèi)皮細(xì)胞分泌的舒張因子及收縮因子的動(dòng)態(tài)平衡被打破，機(jī)體炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)等途徑被激活，是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素，也是心血管疾病發(fā)生的主要因素[4]。近年來(lái)，以動(dòng)脈血管內(nèi)皮功能調(diào)節(jié)、炎癥機(jī)制為靶點(diǎn)，探索高血壓治療途徑方面的研究為學(xué)者們關(guān)注的熱點(diǎn)。無(wú)患子皂苷是野生落葉喬木無(wú)患子果皮的提取物，主要表面活性成分為三萜皂苷類(Ⅰ)、倍半萜糖苷類(Ⅱ)、脂肪油和蛋白質(zhì)。《本草綱目》中記載，無(wú)患子皂苷具有清熱、祛痰、消積等功效，可用于咳喘、腫毒等癥的治療[5]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究也證實(shí)，無(wú)患子皂苷能夠有效緩解疾病相關(guān)的鎮(zhèn)痛、抗菌、消炎等癥狀[6]。本研究探討了無(wú)患子皂苷對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血壓調(diào)節(jié)的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

替米沙坦(江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20050714)；戊巴比妥鈉(美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)，上海化學(xué)試劑廠分裝，批號(hào)84-06-12)；一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素-1(ET-1)、血栓素A2(TXA2)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、C反應(yīng)蛋白(CRP)ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。無(wú)創(chuàng)動(dòng)物血壓測(cè)量系統(tǒng)(北京軟隆生物技術(shù)有限公司，型號(hào)：BP-2010A)；酶標(biāo)儀(EXL-800型，美國(guó))。

無(wú)患子皂苷的制備：無(wú)患子成熟果實(shí)，經(jīng)水洗、晾干、去籽、粉碎，加12倍量水煎煮3次，每次1 h，過(guò)濾后，上大孔吸附樹(shù)脂柱，以此用水和梯度酒精洗脫，收集洗脫液，用混合溶劑萃取，得無(wú)患子皂苷。經(jīng)紫外分光光度法測(cè)定，得到含量為96%的無(wú)患子皂苷。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

8只健康SD大鼠，SPF級(jí)，雄性，12周齡，體重200～250 g，購(gòu)于安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(皖)2007-001；設(shè)為對(duì)照組。40只自發(fā)性高血壓大鼠(尾動(dòng)脈收縮壓>140 mmHg)，SPF級(jí)，雄性，12周齡，體重200～250 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2007-001。隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、無(wú)患子皂苷低劑量組、無(wú)患子皂苷中劑量組、無(wú)患子皂苷高劑量組，每組8只。所有大鼠分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，室溫20～25 ℃，濕度55%～60%，每天通風(fēng)2～3次，每次1 h；自由攝食飲水。

1.3 方法

1.3.1 各組大鼠給藥方法

對(duì)照組、模型組大鼠：每日灌胃生理鹽水，10 mL/(kg·d)，連續(xù)灌胃14 d。陽(yáng)性對(duì)照組：每日灌胃替米沙坦，20 mg/(kg·d)，連續(xù)灌胃14 d。無(wú)患子皂苷低劑量組、中劑量組、高劑量組，分別每日灌胃無(wú)患子皂苷，20 mg/(kg·d)、50 mg/(kg·d)、70 mg/(kg·d)，連續(xù)灌胃14 d。

1.3.2 大鼠尾動(dòng)脈收縮壓檢測(cè)

各組大鼠分別于每日給藥前、給藥后1、2、3 h，應(yīng)用無(wú)創(chuàng)動(dòng)物血壓測(cè)量系統(tǒng)測(cè)定尾動(dòng)脈收縮壓，連續(xù)測(cè)定3次，取平均值為檢測(cè)結(jié)果。

1.3.3 大鼠血清中血管活性物質(zhì)、炎癥因子水平檢測(cè)

各組大鼠分別于末次給藥后1 h，腹腔麻醉(0.4%戊巴比妥鈉，40 mg/kg)，腹主動(dòng)脈采血5 mL。室溫靜置5 min，3000 r/min離心15 min，分離血清。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清中一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素-1(ET-1)、血栓素A2(TXA2)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、C反應(yīng)蛋白(CRP)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 無(wú)患子皂苷對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠尾動(dòng)脈收縮壓的影響

給藥后1、2、3 h，陽(yáng)性對(duì)照組、無(wú)患子皂苷低劑量組、無(wú)患子皂苷中劑量組、無(wú)患子皂苷高劑量組的大鼠尾動(dòng)脈收縮壓值均顯著低于給藥前(P<0.05)。模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、無(wú)患子皂苷低劑量組、無(wú)患子皂苷中劑量組、無(wú)患子皂苷高劑量組的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的大鼠尾動(dòng)脈收縮壓值均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。陽(yáng)性對(duì)照組、無(wú)患子皂苷低劑量組、無(wú)患子皂苷中劑量組、無(wú)患子皂苷高劑量組給藥后各時(shí)間點(diǎn)的大鼠尾動(dòng)脈收縮壓值均顯著低于模型組(P<0.05)。給藥后1、2、3 h，無(wú)患子皂苷低劑量組、無(wú)患子皂苷中劑量組、無(wú)患子皂苷高劑量組的大鼠尾動(dòng)脈收縮壓值與陽(yáng)性對(duì)照組間無(wú)顯著差異(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 無(wú)患子皂苷對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血清中血管活性物質(zhì)的影響

模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、無(wú)患子皂苷低劑量組、無(wú)患子皂苷中劑量組、無(wú)患子皂苷高劑量組的血清NO水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，血清ET-1、TXA2水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。陽(yáng)性對(duì)照組、無(wú)患子皂苷低劑量組、無(wú)患子皂苷中劑量組、無(wú)患子皂苷高劑量組的血清NO水平顯著高于模型組(P<0.05)，血清ET-1、TXA2水平均顯著低于模型組(P<0.05)。無(wú)患子皂苷中劑量組、高劑量組血清NO水平顯著高于低劑量組(P<0.05)；高劑量組血清NO水平顯著高于中劑量組(P<0.05)。無(wú)患子皂苷中劑量組、高劑量組血清ET-1水平顯著低于低劑量組(P<0.05)；高劑量組血清ET-1水平顯著低于中劑量組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 無(wú)患子皂苷對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血清中炎癥因子的影響

模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、無(wú)患子皂苷低劑量組、無(wú)患子皂苷中劑量組、無(wú)患子皂苷高劑量組血清中IL-6、TNF-α、CRP水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。陽(yáng)性對(duì)照組、無(wú)患子皂苷低劑量組、無(wú)患子皂苷中劑量組、無(wú)患子皂苷高劑量組血清中IL-6、TNF-α、CRP水平均顯著低于模型組(P<0.05)。無(wú)患子皂苷中劑量組、高劑量組大鼠血清IL-6、TNF-α、CRP水平均顯著低于低劑量組(P<0.05)，高劑量組血清IL-6、TNF-α、CRP均顯著低于中劑量組(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表1 無(wú)患子皂苷對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠尾動(dòng)脈收縮壓的影響

表2 無(wú)患子皂苷對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血清中血管活性物質(zhì)的影響

表3 無(wú)患子皂苷對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血清中炎癥因子的影響

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)患子皂苷在降低高血壓模型大鼠血壓方面具有一定的作用，但相關(guān)作用機(jī)制尚不完全明確[7]。本研究結(jié)果也顯示，經(jīng)無(wú)患子皂苷給藥治療后，自發(fā)性高血壓大鼠的尾動(dòng)脈收縮壓顯著降低，血壓降低的水平與應(yīng)用替米沙坦(常規(guī)降壓藥)的陽(yáng)性對(duì)照組比較無(wú)顯著差異。證實(shí)了無(wú)患子皂苷在降低血壓方面的有效性。為了進(jìn)一步探索無(wú)患子皂苷降低血壓的作用機(jī)制，本研究進(jìn)一步分析了無(wú)患子皂苷對(duì)高血壓大鼠血清中血管活性物質(zhì)和炎癥因子的影響。

NO是內(nèi)皮細(xì)胞釋放的，具有舒張血管、抑制炎癥反應(yīng)等作用的重要物質(zhì)。現(xiàn)已明確，當(dāng)血管內(nèi)皮功能損傷時(shí)，由于內(nèi)皮NO合成酶活性降低，機(jī)體NO合成減少，血管內(nèi)環(huán)境發(fā)生相應(yīng)的改變，可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[8]。ET-1是公認(rèn)的、具有較強(qiáng)縮血管功能的物質(zhì)，機(jī)體內(nèi)較低水平的ET-1即可維持較強(qiáng)的血管張力，導(dǎo)致血管收縮[9]。TXA2是花生四烯酸的代謝產(chǎn)物，能夠引起血管收縮，參與血管張力的調(diào)控過(guò)程和血栓的形成過(guò)程[10]。以上三種物質(zhì)均是調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能的重要因子。本研究中，高血壓模型組大鼠的血清NO水平顯著低于對(duì)照組，血清ET-1、TXA2水平顯著高于對(duì)照組，證實(shí)了高血壓狀態(tài)下相應(yīng)血管活性物質(zhì)的變化趨勢(shì)，即舒張血管活性物質(zhì)水平有所降低，收縮血管活性物質(zhì)水平有所增加。經(jīng)過(guò)相應(yīng)的藥物治療后，陽(yáng)性對(duì)照組、無(wú)患子皂苷治療各組的血清NO、ET-1、TXA2水平均出現(xiàn)了顯著的改變。證實(shí)了降血壓藥物改善血管活血物質(zhì)的作用，也證實(shí)了無(wú)患子皂苷可通過(guò)調(diào)節(jié)血管活性物質(zhì)水平來(lái)改善高血壓大鼠的高血壓狀態(tài)。通過(guò)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，無(wú)患子皂苷的劑量越高，高血壓大鼠血清中的NO、ET-1水平變化越明顯。這為后續(xù)的無(wú)患子皂苷治療高血壓的劑量研究奠定了基礎(chǔ)。

除了以上血管舒縮功能受損機(jī)制以外，炎癥機(jī)制也是高血壓發(fā)生后動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和發(fā)展的重要影響因素。IL-6是一種功能廣泛的多效性細(xì)胞因子，在應(yīng)激反應(yīng)、感染等其他情況下的急性炎癥反應(yīng)過(guò)程中均可快速生成[11-12]。TNF-α是一種多向性的促炎性細(xì)胞因子，在誘導(dǎo)多種急性炎癥相關(guān)性疾病中發(fā)揮重要作用[13]。CRP是在機(jī)體受到感染或組織損傷時(shí)血漿中一些急劇上升的蛋白質(zhì)，參與了炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生[14-15]。本研數(shù)據(jù)顯示，自發(fā)性高血壓大鼠(模型組)的血清IL-6、TNF-α、CRP水平均顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明高血壓狀態(tài)下，大鼠血清中的炎癥相關(guān)因子呈現(xiàn)出較高水平的狀態(tài)。經(jīng)過(guò)相應(yīng)的藥物治療后，陽(yáng)性對(duì)照組、無(wú)患子皂苷各劑量組大鼠血清中的IL-6、TNF-α、CRP水平均較模型組比較有所降低。可見(jiàn)，無(wú)患子皂苷能夠顯著降低高血壓大鼠血清中的炎癥因子水平。更進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，無(wú)患子皂苷的劑量越高，高血壓大鼠血清中的IL-6、TNF-α、CRP水平越低，證實(shí)了無(wú)患子皂苷治療高血壓過(guò)程中的劑量依賴性。

綜上所述，血管內(nèi)皮功能和炎癥水平的改變?cè)谧园l(fā)性高血壓的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。無(wú)患子皂苷對(duì)自發(fā)性高血壓的降壓作用明顯，其作用機(jī)制可能與改善血管內(nèi)皮功能，降低機(jī)體炎癥水平有關(guān)。