王明波

(錦州醫(yī)科大學，遼寧 錦州 121000)

舌鱗癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率約占口腔癌 1/3～1/2，臨床治療主要以手術治療為主，以放療及化療為輔[1-3]。由于舌的淋巴管及血運豐富，并且舌的活動頻繁，舌癌極易發(fā)生區(qū)域淋巴結及遠處轉移，手術不易完全清除?；熆稍谝欢ǔ潭壬峡刂颇[瘤的負荷量，但舌癌對化療及放療敏感性差，導致化療效果不佳，從而引起腫瘤的復發(fā)及轉移[4-5]。異土木香內(nèi)酯來源于菊科旋覆花屬植物土木香的干燥根，屬多年生草本植物。異土木香內(nèi)酯(isoalantolactone，IAL)是從土木香中提取的半萜烯內(nèi)酯類小分子化合物。研究表明，異土木香內(nèi)酯能抗真菌和細菌的作用，能夠顯著抑制金黃色葡萄球菌agr二元調(diào)控系統(tǒng)，依賴性地降低金黃色葡萄球菌SEA和SEB的表達[6]。最近研究表明，異土木香內(nèi)酯也有抗腫瘤的作用，IAL可抑制膀胱癌細胞株T24細胞增殖，促進細胞凋亡[7]。IAL通過上調(diào)p38-MAPK來抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移侵襲[8]，IAL通過激活p53從而使人肺鱗狀癌細胞凋亡[9]。本實驗通過研究異土木香內(nèi)酯對Tca8113細胞增殖、凋亡的影響及其機制，來探討異土木香內(nèi)酯對舌癌的治療可能性。

1 實驗材料

舌鱗癌細胞株Tca8113(錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院外科重點實驗室提供)，1640培養(yǎng)基(SoLarbio)，DMEM培養(yǎng)基(soLarbio)，胎牛血清(BIOIND)，胰酶(servicebio)，DMSO(SoLarbio)，CCK-8溶液(瑟歐生物)，EDU試劑盒(銳博生物)，transweLL小室(NEST)，TUNEL凋亡檢測試劑盒(塞維爾生物)，96孔板(NEST)，離心管(NEST)。倒置顯微(UOPDSY5000X)，酶標儀(BECKman couLter AD340)。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)

舌癌細胞Tca8113來源于錦州醫(yī)科大學，在-80 ℃冰箱取出復蘇后，在 37 ℃、5%CO2，進行培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞，用PBS洗滌1～2遍，并用2 mL胰蛋白酶加入培養(yǎng)皿中進行消化，將消化好的混懸液1000 rpm條件下離心5 min；按照DMSO∶胎牛血清=1∶9的比例配置細胞凍存液；棄去上清，在離心管中加入凍存液，重懸細胞；通過細胞計數(shù)調(diào)整懸液濃度，吸取1～1.5 mL懸液，移至凍存管中，做好標記；將凍存管依次放入4 ℃、-20 ℃冰箱各30 min，再放入液氮內(nèi)的凍存盒里凍存。

2.2 異土木香內(nèi)酯作用于Tca8113細胞的IC50值

將用DMSO稀釋成10、20、40、80、120、160 μM的溶液待用，實驗組為不同濃度的異土木香內(nèi)酯溶液，對照組為DMSO稀釋液，將預先制備好的細胞懸液按每孔100 μL加入96孔培養(yǎng)板，(每組6個復孔)，然后將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預培養(yǎng)24 h(37 ℃，5% CO2)。24 h后，從培養(yǎng)箱里取出培養(yǎng)板，每孔加入10 μL不同濃度異土木香內(nèi)酯溶液和DMSO稀釋液繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后，采用CCK8試劑盒進行檢測，用酶標儀測定在450 nm處的每個孔的吸光值，記錄測量值，測算各組細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=[1-(實驗組OD值-空白OD值)/(對照組OD值-空白OD值)]×100 %。

2.3 應用CCK8法檢測異土木香內(nèi)酯對TCA8113細胞增殖能力的影響

實驗分為對照組合實驗組，實驗組為20 μM的異土木香內(nèi)酯DMSO稀釋溶液，對照為DMSO稀釋液。將預先制備好的細胞懸液按每孔100 μL加入96孔培養(yǎng)板，(每組不少于5個復孔)，然后將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預培養(yǎng)24 h(37 ℃，5% CO2)。24 h后，從培養(yǎng)箱里取出培養(yǎng)板，每孔加入 10 μL 待測物質(zhì)后放回培養(yǎng)箱持續(xù)孵育。分別在0、12、24、36 h，從培養(yǎng)箱里取出培養(yǎng)板，再向每孔加入10 μL CCK8工作液。再次放回培養(yǎng)箱孵育1～2 h，后拿出培養(yǎng)板用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。并記錄實驗數(shù)據(jù)。

2.4 EDU法檢測異土木香內(nèi)酯對Tca8113細胞增值力的影響

將預先制備好的細胞懸液按每孔100 μL加入96孔培養(yǎng)板，分為兩組，每組2個復孔，實驗組為20 μM的異土木香內(nèi)酯DMSO稀釋溶液，對照為DMSO稀釋液。首先將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱，37 ℃，5% CO2，培養(yǎng)至正常生長狀態(tài)。然后配制適量的EDU試劑，并進標記，經(jīng)固定染色后，在熒光顯微鏡下，觀察細胞顏色并拍照，紫外光下，細胞核全染為藍色，綠光下增殖細胞核染為紅色。

2.5 細胞劃痕實驗檢測異土木香內(nèi)酯對Tca8113細胞遷移能力影響實驗

實驗仍分為兩組，每組2個重復，實驗組為20 μM的異土木香內(nèi)酯DMSO稀釋溶液，對照為DMSO稀釋液。將Tca8113細胞接種于6孔板中，過夜培養(yǎng)，鋪滿底部。第2天用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕，用PBS洗細胞3次，去處劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基。放入37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。按0、6、12、24 h，分別對實驗組和對照組進行拍照，并記錄劃痕位置及寬度。用Photoshop軟件計算劃痕前后細胞之間空白處面積差(單位：像素)，取平均值，計算遷移率。遷移率=(劃痕0 h空白處面積-劃痕后 24 h空白處面積)/劃痕0 h空白處面積。

2.6 Transwell 侵襲實驗檢測異土木香內(nèi)酯對Tca8113細胞侵襲能力影響實驗

實驗仍分為兩組，每組2個重復，實驗組為20 μM的異土木香內(nèi)酯DMSO稀釋溶液，對照為DMSO稀釋液。在培養(yǎng)瓶中加入胰酶進行消化，調(diào)整細胞至合適密度觀察計數(shù)。24孔板中，在下室加入400 μL完全培養(yǎng)基，上室加入不含血清的細胞懸液200 μL，然后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，用多聚甲醛固定25 min，生理鹽水清洗3次，加入結晶紫進行染色40 min，在顯微鏡下比較兩者之間的差異性，記錄測量值，利用GraphPad軟件輔助分析實驗結果。

2.7 Tunel實驗異土木香內(nèi)酯對Tca8113細胞凋亡的影響

實驗仍分為兩組，每組2個重復，實驗組為20 μM的異土木香內(nèi)酯DMSO稀釋溶液，對照為 DMSO稀釋液。在24孔板上培養(yǎng)貼壁細胞。按照TμNEL凋亡檢測試劑盒說明書進行檢測。處理好的樣本立即在熒光顯微鏡下分析拍照，載玻片注意避光。DAPI能將凋亡和未凋亡的細胞都染成藍色，只在凋亡的細胞核中才有CF640-dUTP摻入而定位的綠色熒光。

2.8 Western Blot檢測相關蛋白表達的影響

準備4組對數(shù)生長期的Tca8113細胞，每瓶細胞數(shù)基本保持一致，實驗設置實驗組、對照組和空白對照組。實驗組：配制10 μM和20 μM的異土木香內(nèi)酯溶液，將配置好的異土木香內(nèi)酯溶液分別接種Tca8113細胞；同時以 0.5% DMSO 處理組作為對照濃度；空白對照組為不做任何處理的Tca8113細胞。分別提取總蛋白，采用BCA試劑盒進行蛋白定量，經(jīng)采用SDS-PAGE電泳、轉印、染色照相后。分別檢測舌癌細胞Tca8113的GAPDH內(nèi)參蛋白，Caspase3、Bcl-2蛋白的表達水平，來檢測異土木香內(nèi)酯對舌癌細胞的作用。

3 實驗結果

3.1 異土木香內(nèi)酯作用于Tca8113細胞的IC50值

經(jīng)檢測，對照組、10、20、40、80、120、160 μM組的平均吸光值分別為0.451、0.285、0.224、0.235、0.221、0.235和0.274。通過與對照組比較計算，得出即 IC50值為20 μM。在后續(xù)實驗中，異土木香內(nèi)酯的作用濃度均為 20 μM，見圖1。

圖1 不同濃度異土木香內(nèi)酯作用于Tca8113細胞的OD值

3.2 異土木香內(nèi)酯對Tca8113細胞活力影響實驗結果

通過CCK-8法檢測20 μM異土木香內(nèi)酯在36 h內(nèi)對Tca8113細胞活性的影響，經(jīng)檢測，隨著時間增加，實驗組的Tca8113細胞活性逐漸降低，見圖2。

*P<0.05

3.3 異土木香內(nèi)酯對 Tca8113 細胞克隆形成能力影響實驗

實驗結果顯示，在7 d內(nèi)，與對照組相比，實驗組的克隆數(shù)明顯減少。20 μM異土木香內(nèi)酯對Tca8113細胞增殖能力具有明顯的抑制作用，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖3。

***P<0.001

3.4 異土木香內(nèi)酯對Tca8113細胞增殖力影響實驗

EDU實驗檢測證明：實驗組與對照組相比增殖能力明顯減弱，以P<0.01為差異有統(tǒng)計學意義。以上結果提示，20 μM異土木香內(nèi)酯對Tca8113細胞增殖能力具有抑制作用，見圖4。

**P<0.01

3.5 異土木香內(nèi)酯對Tca8113 細胞遷移能力影響實驗結果

劃痕實驗結果顯示，實驗組與對照組相比，Tca8113細胞爬行距離變小，以P<0.01為差異有統(tǒng)計學意義，表明細胞遷移能力明顯減小，見圖5，遷移率見表1。說明20 μM的異土木香內(nèi)酯對Tca8113細胞遷移能力具有抑制作用。

圖5 實驗組與對照組劃痕實驗0 h與24 h比較

表1 實驗組與對照組細胞遷移率比較

**P<0.01

3.6 異土木香內(nèi)酯對Tca8113細胞侵襲能力影響實驗結果

Transwell實驗表明，實驗組與對照組相比，侵襲能力明顯減弱，以P<0.01為差異具有統(tǒng)計學意義。如圖7所示，表明異土木香內(nèi)酯對Tca8113細胞侵襲能力具有抑制作用。

3.7 異土木香內(nèi)酯對Tca8113細胞凋亡影響實驗結果

Tunel實驗結果顯示，實驗組與對照組相比，Tca8113細胞凋亡明顯增多，以P<0.01為差異有統(tǒng)計學意義。結果表明20 μM異土木香內(nèi)酯對Tca8113細胞凋亡具有促進作用，見圖8。

**P<0.01

**P<0.01

3.8 Western Blot

結果表明，不同處理組的內(nèi)參蛋白GAPDH的表達水平無差異，表明其幾乎不受其他因素影響，可以作為內(nèi)參得到每個樣品的相對含量。與對照組相比，異土木香內(nèi)酯組的抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低，而促凋亡蛋白Caspase-3活性水平均顯著增加，與濃度呈正相關，以P<0.01為差異有統(tǒng)計學意義，見圖9。

圖9 Western Blot實驗結果圖

近年來，舌癌的發(fā)生率有上升的趨勢，且其惡性程度較高，生長快，浸潤性強。舌癌晚期波及口底、下頌骨，向后侵及腭舌弓及扁桃體；侵及舌根部或伴繼發(fā)感染時發(fā)生劇烈疼痛。對于惡性舌癌的治療以手術為主聯(lián)合其他治療方法，根據(jù)患者的具體情況來實施治療方案。一般來說，手術切除原發(fā)病灶，手術解決的是局部病灶及手術可涉及范圍內(nèi)的病灶，但對于已有遠處轉移病例的治療或在預防復發(fā)方面是無能為力的，這時依靠化學藥物治療或生物治療具有一定的療效。另外，利用中藥治療配合手術治療、放射治療和化學治療可起到很好的治療效果，因為中藥治療能提高免疫功能，從而起到提高和鞏固療效的作用。已有研究經(jīng)證實，有數(shù)百種中藥材具有抑制腫瘤癌細胞生長的作用，諸如百安、參陽、苗藍、黃寄素、清瘤亮喉等在體外實驗研究、治療或輔助治療口腔鱗癌中，均顯示出了明顯的殺腫瘤作用[10-13]。本研究對異土木香內(nèi)酯對舌癌Tca8113細胞的影響及其可能的產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用的機制進行了探討，本研究中采用CCK-8法測出異土木香內(nèi)酯對Tca8113細胞 IC50值為20 μM，且在36 h內(nèi)，異土木香內(nèi)酯對Tca8113細胞活性具有明顯的抑制作用。已有研究表明異土木香內(nèi)酯對膀胱癌T24細胞的IC50值為22.45 μmol/L[14]。通過EDU實驗發(fā)現(xiàn)，20 μM的異土木香內(nèi)酯可以抑制舌癌Tca8113細胞增殖，這些實驗結果說明異土木香內(nèi)酯可能在治療舌癌中具有潛在的可能性。癌細胞遷移和侵襲是發(fā)生癌轉移的基礎[15]，本實驗中，細胞劃痕實驗和Transwell實驗結果表明0 μM的異土木香內(nèi)酯可以有效的抑制舌癌Tca8113細胞的遷移和侵襲。Tunnel實驗證明其可以誘導Tca8113細胞凋亡。其可能原因是其可以調(diào)節(jié)細胞的代謝通路。有文獻報道，異土木香內(nèi)酯可以通過上調(diào)p38-MAPK誘導胰腺癌PANC-1細胞凋亡[16-18]和抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移侵襲[19]，激活p53來誘導人肺鱗狀癌細胞凋亡，還有文獻報道其通過增加ROS誘導前列腺癌PC3細胞凋亡[20-22]。

綜上所述，異土木香內(nèi)酯對舌癌細胞具有抑制作用，但是其作用機制還需要進步研究。發(fā)現(xiàn)其在舌癌臨床應用前景及價值。

4 討 論

本研究對異土木香內(nèi)酯對舌癌Tca8113細胞的影響及其可能的產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用的機制進行了探討。研究中通過CCK8實驗，對異土木香內(nèi)酯的體外藥效做了初步研究，以舌癌Tca8113 細胞為研究對象，研究異土木香內(nèi)酯對舌癌Tca8113細胞的抑制作用，CCK8結果顯示，在孵育時間為24 h內(nèi)，異土木香內(nèi)酯對舌癌Tca8113細胞的IC50值為20 μM，在0～20 μM 濃度范圍，隨著濃度增加，抑制作用增強，但是濃度范圍為20～80 μM，抑制作用增強效果不明顯?？寺⌒纬蓪嶒灪虴DU實驗進一步驗證了20 μM 異土木香內(nèi)酯可以抑制舌癌Tca8113細胞增殖，同時抑制細胞克隆形成。細胞劃痕實驗和Transwell實驗結果表明20 μM的異土木香內(nèi)酯可以有效的抑制舌癌Tca8113細胞的遷移和侵襲。但具體機制不明確，因此需要進一步的實驗研究。本研究中通過Tunnel實驗和Western Blot實驗證明，異土木香內(nèi)酯可以誘導Tca8113 細胞凋亡?？赡茉蚴瞧淇梢哉{(diào)節(jié)細胞的代謝通路。

綜上所述，異土木香內(nèi)酯能抑制舌鱗癌 Tca8113細胞的增殖、遷移侵襲并促進Tca8113細胞凋亡，并呈一定濃度時間依賴性。但具體機制不明確，因此需要進一步的實驗研究。