王瑛穎，董欣，劉陽，黃佳娜，王浩

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 錦州 121000；2.山東省醫(yī)用高分子材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 370102)

電紡纖維作為藥物釋放載體應(yīng)用近20年了，采用脂肪族聚酯作為成纖維材料被認(rèn)為是比較理想的選擇，但是脂肪族聚酯的有機(jī)溶液表面張力較大，較難形成形態(tài)理想的纖維。所以，人們嘗試將表面活性劑共溶解在脂肪族聚酯的有機(jī)溶液中以降低體系的表面張力，以期順利靜電紡絲并得到形態(tài)較理想的復(fù)合纖維[1-2]。這其中，非離子型表面活性劑由于其低毒性、良好的共溶解性、對(duì)水不溶藥物較高的增溶作用等，是一種較理想的選擇[3]。被采用的非離子型表面活性劑已經(jīng)有很多，這其中又以Poloxamer188最為理想，并得到了較多的研究。原因主要有4點(diǎn)：(1)Poloxamer188低溶血性、低毒性、可腎排泄，生物學(xué)性質(zhì)良好，是現(xiàn)有的屈指可數(shù)的可以靜脈注射的表面活性劑；(2)電紡纖維比表面積大，在制備過程中會(huì)較多的接觸氣體環(huán)境，Poloxamer188分子中主要為碳-碳單鍵和醚健，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，尤其是對(duì)空氣中的氧氣、二氧化碳、水蒸氣穩(wěn)定；(3)Poloxamer188對(duì)很多水不溶化合物的增溶，且增溶量很高；(4)Poloxamer188相對(duì)廉價(jià)、易得[4-5]。

現(xiàn)有的關(guān)于Poloxamer188復(fù)合脂肪族聚酯電紡纖維中的成纖維材料主要集中在聚L-乳酸，對(duì)于聚D-乳酸-co-L-乳酸共聚物、聚乳酸-co-乙醇酸共聚物、聚ε-己內(nèi)酯等研究較少。本論文采用聚D，L-乳酸-co-乙醇酸(poly D，L-lactic acid-co-glycolic acid，PLGA)作為纖維形成的基質(zhì)材料，Poloxamer188為復(fù)合表面活性劑，將模型藥物米托蒽醌(Mitoxantrone)通過與前兩者共溶液-靜電紡絲的方法載入該纖維中?？疾焖美w維的形態(tài)、載藥、釋藥行為。將米托蒽醌載入電紡纖維亦有一定的藥劑學(xué)意義。該藥是治療乳腺癌的首選藥物，對(duì)某些其他腫瘤也有較好的療效。局部給藥劑型：如水凝膠、大粒徑脂質(zhì)體、電紡纖維等，可能會(huì)提高其治療指數(shù)[6-8]。作為植入型藥物新劑型進(jìn)行研究和使用也一直是通過靜電紡絲制備所得微納米級(jí)纖維膜、氈、支架等材料的主要應(yīng)用方向[9-10]。

1 材料與方法

高壓靜電發(fā)生器(東文高壓電源廠，中國(guó)，天津)；臺(tái)式掃描電子顯微鏡(TM3000，Hitachi公司，日本)；高效液相色譜儀(ELITE LaChrom，Shimadzu公司，日本)；PHS-2F精密酸度計(jì)(精科儀器，中國(guó)，上海)。

米托蒽醌原料藥(含量98.9%，美侖生物技術(shù)有限公司，中國(guó)，大連)；n-十二醇引發(fā)開環(huán)聚合并單封端的聚D，L-乳酸-co-乙醇酸(PLGA，由本課題組合成[11]，第1種是摩爾比為乳酸∶乙醇酸=70∶30，D-乳酸∶L-乳酸=50∶50，Mw=15.6萬，多分散系數(shù)PDI=1.36；第2種是摩爾比為乳酸∶乙醇酸=50∶50，D-乳酸∶L-乳酸=50∶50，Mw=14.9萬，多分散系數(shù)PDI=1.41)；Poloxamer188(德國(guó)Basf原產(chǎn)進(jìn)口分裝，美侖生物技術(shù)有限公司，中國(guó)，大連)；二氯甲烷(分析純，天力化學(xué)試劑公司，中國(guó)，天津)；乙酸(分析純，天力化學(xué)試劑公司，中國(guó)，天津)；乙腈(色譜純，光復(fù)精細(xì)化工，中國(guó)，天津)；去離子水(娃哈哈集團(tuán)，中國(guó)，杭州)。

2 方 法

2.1 靜電紡絲與材料表征

首先，配制材料全部溶解、體系均一無分層、3日內(nèi)穩(wěn)定的紡絲溶液以待靜電紡絲。其中PLGA的量每組均設(shè)為1 g，不同樣品中Poloxamer188的量不同，以考察Poloxamer188復(fù)合量對(duì)纖維形態(tài)及藥物釋放的影響。實(shí)驗(yàn)采用均相溶液紡絲法，要求各物質(zhì)均要溶解在溶劑中。為了使得米托蒽醌能夠完全溶解在PLGA-Poloxamer188-二氯甲烷共溶液中，本實(shí)驗(yàn)在該體系中又加入了0.5 mL乙酸。本文試驗(yàn)了兩種PLGA，第1種是摩爾比為乳酸∶乙醇酸=70∶30的；第2種是摩爾比=乳酸∶乙醇酸為50∶50的，發(fā)現(xiàn)在含有米托蒽醌、Poloxamer188和PLGA 3種固體物質(zhì)的二氯甲烷-乙酸的混合溶劑體系中，采用第1種PLGA時(shí)能夠形成所有固態(tài)物質(zhì)完全溶解、無沉淀的共溶液體系，且該體系呈深藍(lán)色；但是采用第2種PLGA時(shí)，體系中的PLGA不能完全溶解。所以，本文提及的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為乙醇酸(摩爾比)為70∶30的PLGA。為了考察纖維中米托蒽醌的載量和Poloxamer188的復(fù)合量對(duì)纖維形態(tài)和藥物釋放經(jīng)時(shí)百分率的影響，設(shè)置了10%、20%、30% 3種Poloxamer188復(fù)合量和15%、30%、45% 3種米托蒽醌載量。所得纖維的命名見表1。

表1 各電紡纖維中Poloxamer188和米托蒽醌對(duì)聚D，L-乳酸-co-乙醇酸的質(zhì)量比率(%)

各種材料加入溶劑后磁力攪拌72 h，得到深藍(lán)色、透明且無不溶物的粘稠溶液。紡絲裝置參考文獻(xiàn)搭建完畢后按如下條件靜電紡絲：紡絲電壓為12 000 V，供液速度為(2.0±0.25) mL/h，紡絲距離(針頭與錫箔平面之間的距離)為25 cm，空氣溫度為(20±2)℃，空氣相對(duì)濕度為(50±2)%。電壓加載后發(fā)現(xiàn)一些溶液從針頭口流出的紡絲液在電場(chǎng)力的作用下能夠順利形成Taylor錐，一些則不能夠。形成的Taylor錐以螺旋軌跡向接收平板運(yùn)行并沉積。紡絲完畢后，接收平板上形成一張由纖維層積而成約(1.1±0.2)mm厚的無紡纖維薄氈。揭下該氈后，(35±2)℃下真空除溶劑72 h，按一定規(guī)格用剪刀切成小片后進(jìn)行表征、藥物釋放等研究[12]。

外觀上所制得的電紡纖維為深藍(lán)色纖維氈，將其剪切成0.5 cm×0.5 cm小片后用導(dǎo)電膠固定在金屬砧上并用金真空蒸鍍，之后用掃描電子顯微鏡進(jìn)行電紡纖維微觀形貌的觀察。

X-射線衍射分析方法：稱量約1 g的電紡產(chǎn)品均勻鋪于玻璃片的凹槽內(nèi)并置于廣角X-射線衍射儀室溫下測(cè)試，掃描范圍：5°～60°，掃描速率：8o/min。

差示熱分析方法：稱量約25 mg電紡產(chǎn)品，置入合金金屬樣品盒內(nèi)壓封，置于差示熱分析儀，氮?dú)饬鞅Ｗo(hù)下溫度從25 ℃升至400 ℃，升溫速率：5 ℃/min。

2.2 藥物釋放

采用高效液相色譜-紫外分光光度法測(cè)定釋放介質(zhì)中米托蒽醌的含量。色譜條件：色譜柱Elite?C18柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-庚烷磺酸鈉溶液(v/v=33/67)；檢測(cè)波長(zhǎng)為244 nm；流速為1 mL/min；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為20 μL。庚烷磺酸鈉溶液的配制為：取4.4 g庚烷磺酸鈉溶于200 mL純水中，加6.4 mL冰醋酸，用水稀釋至730 mL[13]。

將樣品剪切成約5 cm×5 cm正方形條，使得每片的質(zhì)量約為100 mg，浸入30 mL磷酸緩沖鹽釋放介質(zhì)中(磷酸緩沖鹽的配制為：取磷酸二氫鉀0.68 g，加0.1 mol/L氫氧化鈉15.2 mL，用水稀釋至95 mL后用磷酸調(diào)pH為6.4，最終定容至100 mL)。置于恒溫空氣浴搖床中，在37 ℃、100 r/min條件下振搖釋放。在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)取出全部釋放介質(zhì)后按照前述方法進(jìn)行米托蒽醌含量的測(cè)定。之后在釋放介質(zhì)中重新添加30 mL新的釋放介質(zhì)。繪制絕對(duì)釋放量和相對(duì)釋放百分率對(duì)時(shí)間的曲線[14]。

3 結(jié)果與討論

3.1 纖維形態(tài)

所有所得纖維外觀均為深藍(lán)色纖維氈，藍(lán)色的原因顯然是藥物本身的顏色所導(dǎo)致的。圖1為電子顯微鏡下觀察所得纖維的微觀形態(tài)。發(fā)現(xiàn)F-10%-15%、F-10%-30%、F-10%-45%、F-20%-15%、F-20%-30%、F-30%-15%能順利紡絲并形成纖維，其他情形不能順利紡絲形成纖維。這其中，形態(tài)較為理想的纖維是F-10%-30%和F-10%-45%，表現(xiàn)為無珠子結(jié)構(gòu)出現(xiàn)且纖維直徑較為均一。F-10%-15%有很多珠子結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，F(xiàn)-20%-15%、F-20%-30%、F-30%-15%纖維直徑不均一且黏連較為嚴(yán)重，有零星珠子結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。無論纖維形態(tài)理想與否，在纖維表面均無材料分相和結(jié)晶析出現(xiàn)象，提示材料的復(fù)合與藥物的包裹可能較為理想，但是具體情況和藥物的釋放行為還需要進(jìn)一步表征。

在本研究中，待紡溶液中含有米托蒽醌、PLGA、Poloxamer188、二氯甲烷、乙酸等5種物質(zhì)，又由于各種物質(zhì)之間相互復(fù)雜作用，所以該體系是一個(gè)十分復(fù)雜的體系。實(shí)驗(yàn)中亦考察了其他Poloxamer188復(fù)合量和米托蒽醌載量的情形，但是發(fā)現(xiàn)當(dāng)Poloxamer188復(fù)合量較高時(shí)(>30%)，藥物突釋十分明顯，故本文僅考察10%、20%和30%的Poloxamer188復(fù)合量的情形并以此為例探討Poloxamer188復(fù)合量對(duì)纖維形態(tài)及藥物釋放的影響。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)藥物的復(fù)合量對(duì)待紡液的可紡性和纖維形態(tài)亦有明顯影響。另外，當(dāng)Poloxamer188和米托蒽醌的載量發(fā)生變動(dòng)時(shí)，體系會(huì)出現(xiàn)不能紡絲、固體物質(zhì)溶解不完全，顏色過深不能觀察溶解狀態(tài)等情況。這些現(xiàn)象的原因暫時(shí)未能明晰，有待以后繼續(xù)深入研究。

3.2 藥物釋放與材料復(fù)合

圖2A為系列樣品中米托蒽醌的絕對(duì)釋放量，經(jīng)過折算得到經(jīng)時(shí)絕對(duì)釋放量相對(duì)于各樣品載藥量的百分釋放量如圖2B所示?？芍w維中Poloxamer188復(fù)合量與米托蒽醌載藥量對(duì)藥物本身的釋放行為均有影響，兩者在纖維中載量的升高均會(huì)導(dǎo)致米托蒽醌突釋量和平臺(tái)期釋放量的升高。當(dāng)Poloxamer188復(fù)合量從10%增加至20%和30%時(shí)，載藥量10%的纖維的百分釋放量從30.5%增至49.3%和71.0%。當(dāng)Poloxamer188復(fù)合量從10%增加至20%時(shí)，載藥量20%的纖維的百分釋放量從49.3%增至65.3%。當(dāng)Poloxamer188復(fù)合量不變(15%)，米托蒽醌的量從10%增加到20%和30%時(shí)，其百分釋放量從30.5%增加至49.3%和71.0%。

F-10%-15%F-10%-30%F-10%-45%

F-10%-15%#F-10%-30%#F-10%-45%#

F-20%-15%F-20%-30%F-30%-15%

A代表絕對(duì)釋放量；B代表相對(duì)百分釋放量；C代表相對(duì)百分釋放量前24 h局部

米托蒽醌載藥量與Poloxamer188復(fù)合量對(duì)釋放曲線的形狀沒有明顯的影響。所有被考察的電紡產(chǎn)品均由突釋相和平臺(tái)相組成，緩釋相比以往相關(guān)研究的小很多。所考察樣品的突釋量(15 min時(shí)的百分釋放量)均小于30%，但是隨之在12 h之內(nèi)釋藥量迅速上升，并且緩釋期除了F-10%-45%外均小于12 h，即12 h后幾乎再無明顯的釋放增量(12 h后的釋放量<24 h前的10%)，釋放曲線已經(jīng)達(dá)到平臺(tái)相，如圖2(C)所示。在42 d(1008 h)后，各個(gè)纖維中仍然有較多未釋放的藥物。

A從下至上分別代表米托蒽醌、 Poloxamer188、PLGA、F-10%-15%、F-10%-30%、F-10%-45%、F-20%-15%、F-20%-30%、F-30%-15%

由圖3的X-射線衍射圖譜可知，米托蒽醌在5°～30°之間呈現(xiàn)較多的特征峰，Poloxamer188在19.16°和23.32°處有2個(gè)明顯的特征峰，PLGA在量程范圍內(nèi)無特征峰，只有在10°～30°范圍內(nèi)衍射強(qiáng)度較其他2θ處大，形成一個(gè)“饅頭峰”。5種載藥纖維中任何一種載藥纖維的衍射圖譜上均無衍射強(qiáng)度較大即明顯的特征峰，但是F-10%-15%，F(xiàn)-10%-30%和F-20%-15%在“饅頭峰”上有若干衍射強(qiáng)度較小的峰，且在低角度處亦有特征峰出現(xiàn)。但這些峰未能歸屬，可能是材料復(fù)合和載藥過程中出現(xiàn)的結(jié)晶特征，其可能由纖維中的一種物質(zhì)引起，亦可能是纖維中幾種物質(zhì)復(fù)合后所導(dǎo)致的現(xiàn)象?？偟膩碚f，靜電紡絲后具有明顯特征峰的米托蒽醌和Poloxamer188的特征峰均無展現(xiàn)，說明兩者在纖維表面分散良好，這是藥物釋放的前提。

A從下至上分別代表米托蒽醌、Poloxamer188、PLGA、F-10%-15%、F-10%-30%、F-10%-45%、F-20%-15%、F-20%-30%、F-30%-15%

圖4為纖維中3種原料和系列載藥電紡纖維樣品的差示熱分析曲線，發(fā)現(xiàn)米托蒽醌和 Poloxamer188 均對(duì)電紡纖維的熱分析曲線有明顯影響。熱分析曲線展現(xiàn)了米托蒽醌的兩個(gè)尖銳的吸熱峰，在76.4 ℃和175.9 ℃；Poloxamer188有一個(gè)較寬的放熱峰，谷值在227.9 ℃和274.6 ℃，且該峰較為寬泛，跨度從150 ℃～300 ℃；PLGA原料的分解峰較大，峰值在353.7 ℃。靜電紡絲后，米托蒽醌的峰未明顯出現(xiàn)，說明該藥物較好復(fù)合在電紡纖維中，佐證了X-射線衍射的結(jié)果。另一方面，載藥電紡纖維的在較高溫度時(shí)曲線上呈現(xiàn)較多變化，體現(xiàn)在均有放熱峰的存在，這可能是Poloxamer188的復(fù)合引起的。但是放熱峰的大小很不同，對(duì)于F-10%-15%、F-10%-30%和 F-10%-45%，其放熱峰相比F-20%-15%、F-20%-15%和F-30%-15%?。籉-10%-15%和F-10%-30%的峰谷位均在300 ℃以下，與Poloxamer188原料的峰谷位較為相近。F-30%-15%、F-20%-15%和F-20%-15%的峰谷位在300 ℃～350 ℃之間，遠(yuǎn)離Poloxamer188原料的峰谷位。這說明，Poloxamer188復(fù)合量的升高導(dǎo)致了復(fù)合效應(yīng)的增大，而復(fù)合效應(yīng)增大有可能導(dǎo)致藥物釋放量的增高，這佐證了藥物釋放量的結(jié)果。F-10%-15%、F-10%-30%和 F-10%-45% 3者中，隨著載藥量的增高，峰谷位逐漸向高溫移動(dòng)，亦說明復(fù)合效應(yīng)的增強(qiáng)，亦會(huì)導(dǎo)致藥物釋放量的增高，藥物釋放量的結(jié)果同樣解釋了這一點(diǎn)。

一般地，X-射線衍射的結(jié)果只能夠說明纖維表面材料復(fù)合的狀態(tài)，但纖維內(nèi)部材料復(fù)合情況需要差示熱分析等手段進(jìn)行表征，綜合本實(shí)驗(yàn)中X-射線衍射和差示熱分析的結(jié)果可以得知，對(duì)于F-10%-15%、F-10%-30%和F-10%-15%，纖維表面有些許小峰提示了表面復(fù)合的不完全，且前兩者纖維內(nèi)部的復(fù)合亦不如其他纖維?？梢妰煞N表征結(jié)果互為佐證。

根據(jù)藥物釋放的結(jié)果和X-射線衍射、差示熱分析的表征結(jié)果，以及相似研究?jī)?nèi)容文獻(xiàn)中的信息，可以得出以下3點(diǎn)結(jié)論：(1)雖然米托蒽醌在15 min后的釋放量不是很大，但是在12 h內(nèi)便會(huì)達(dá)到最大釋放量，12 h內(nèi)的釋放量可以認(rèn)為是該系列纖維的突釋量，這提示了相當(dāng)比例的藥物存在于纖維表面或近纖維表面的部位，但是以形成無定型復(fù)合物狀態(tài)存在；(2)Poloxamer188復(fù)合量的升高、米托蒽醌的載量升高均有助于藥物本身的釋放，可能原因?yàn)閮烧咻d量較多時(shí)均能夠形成致孔效應(yīng)，材料間的良好復(fù)合是藥物能夠較大量釋放的前提；(3)平臺(tái)期后仍然有相當(dāng)比例的米托蒽醌沒有被釋放及其釋放曲線在較短的時(shí)間內(nèi)即達(dá)到平臺(tái)期等現(xiàn)象說明有相當(dāng)部分的米托蒽醌在纖維中與PLGA結(jié)合緊密，難以在纖維基質(zhì)內(nèi)部移動(dòng)，這可能是由于米托蒽醌中蒽醌上的羥基和側(cè)鏈上的胺基等與PLGA發(fā)生氫鍵作用進(jìn)而緊密結(jié)合所導(dǎo)致的[14-16]1-5，這需要進(jìn)一步的研究。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用均相溶液紡絲法制備載有米托蒽醌的Poloxamer188復(fù)合PLGA電紡纖維，并在紡絲液中添加乙酸使米托蒽醌充分溶解。發(fā)現(xiàn)當(dāng)米托蒽醌的載量在10%Poloxamer188復(fù)合量在30%和45%時(shí)能夠得到形態(tài)較為理想的纖維。當(dāng)米托蒽醌的載量在30%Poloxamer188復(fù)合量在15%時(shí)藥物的百分釋放量最高。本研究提供了聚D，L-乳酸-co-乙醇酸(摩爾比乳酸∶乙醇酸=70∶30，D-乳酸∶L-乳酸=50∶50)電紡纖維中Poloxamer188及米托蒽醌載量對(duì)纖維形態(tài)及釋藥行為影響的初步信息。