杜國(guó)新，張東蕾

（1. 遼寧何氏醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院， 遼寧 沈陽(yáng) 110163； 2. 沈陽(yáng)眼產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司， 遼寧 沈陽(yáng) 110163）

青光眼是一組引起視神經(jīng)損傷和視力喪失的眼病，以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞進(jìn)行性變性為特征。幾種不同類(lèi)型的青光眼都有視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡，神經(jīng)元的細(xì)胞體在視網(wǎng)膜內(nèi)部，它們的長(zhǎng)軸突形成視神經(jīng)，這些神經(jīng)元的退化導(dǎo)致一系列形態(tài)改變，其中最顯著的是視盤(pán)的“凹陷”(視神經(jīng)損傷)，視力永久喪失[1]。青光眼影響著全世界7 000 多萬(wàn)人，其中10%為雙側(cè)失明，是引起世界上不可逆失明的主要原因[2]。在青光眼的幾種亞型中，原發(fā)性開(kāi)角型青光眼和原發(fā)性閉角型青光眼在亞洲地區(qū)均較為常見(jiàn)，前者占比近2.3%后者占比近1.1%。由于亞洲人口規(guī)模較大，全球原發(fā)性開(kāi)角型青光眼的50%以上以及原發(fā)性閉角型青光眼的75%以上發(fā)生在亞洲[3]。鑒于青光眼發(fā)病率與高齡的正相關(guān)關(guān)系，隨著中國(guó)老齡化的到來(lái)，青光眼預(yù)計(jì)成為中國(guó)老年眼科疾病亟待解決的重大問(wèn)題[4]。

青光眼的危險(xiǎn)因素包括眼壓升高、家族病史和高血壓等。目前，青光眼的藥理學(xué)治療主要是通過(guò)減少房水的產(chǎn)生或改善房水的流出降低升高的眼壓，降低眼壓是治療青光眼為數(shù)不多的方法之一[5]。在人眼中，有60%～80%房水經(jīng)由前房角的小梁網(wǎng)-施萊姆式管通道流出眼外，另有約15%房水經(jīng)由葡萄膜鞏膜通道流出眼外[6]。但是目前臨床上常見(jiàn)的治療青光眼的藥物，例如，β受體阻滯劑、碳酸酐酶抑制劑和前列腺素F2α類(lèi)似物，它們均是通過(guò)增強(qiáng)葡萄膜鞏膜通道的房水流出來(lái)降低眼壓[7]。從現(xiàn)有的研究成果來(lái)看，開(kāi)發(fā)一種新型的經(jīng)由小梁網(wǎng)-施萊姆式管通道增加房水外流的藥物，是對(duì)現(xiàn)有抗青光眼藥物不同作用機(jī)制的有利補(bǔ)充。

ROCK 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是Rho GTPase 的重要下游效應(yīng)因子，在調(diào)節(jié)平滑肌組織的收縮張力中起著關(guān)鍵作用[8]。ROCK 有兩種亞型(ROCK1 和ROCK2)，兩者都在人類(lèi)小梁網(wǎng)和睫狀體肌細(xì)胞中表達(dá)。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，使用選擇性抑制劑調(diào)節(jié)房水流出通道中的ROCK 活性，對(duì)青光眼患者眼壓升高的治療有非常顯著的好處，這些抑制劑可以增加房水通過(guò)小梁網(wǎng)的引流，導(dǎo)致眼壓下降[9]。截至2020年7月，目前全世界已經(jīng)有兩款ROCK 抑制劑治療青光眼的藥物成功上市[10]。一個(gè)是于2014年在日本上市的Ripasudil (圖1)，其ROCK1 和ROCK2 的IC50分別為51 nM 和19 nM；另一個(gè)是于2017年在美國(guó)上市的Netarsudil (圖1)，其ROCK2 的IC50為10 nM。通過(guò)查閱相關(guān)專(zhuān)利文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)化合物II (圖1)報(bào)道有一定的ROCK2 活性，其IC50為10 μM[11]。

圖1 已上市ROCK 抑制劑藥物和化合物Ⅱ的結(jié)構(gòu)

為了開(kāi)發(fā)具有中國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的，能夠治療青光眼的創(chuàng)新藥，本論文試圖找到具有全新骨架藥效團(tuán)的新化合物，具有一定的體外ROCK2 抑制劑活性，即可滿足自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的需求，同時(shí)又能有力抵抗專(zhuān)利藥知識(shí)產(chǎn)權(quán)的爭(zhēng)奪戰(zhàn)，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)我國(guó)治療青光眼的創(chuàng)新藥打下基礎(chǔ)。

1 結(jié)果與討論

1.1 目標(biāo)化合物的設(shè)計(jì)

將化合物II 的骨架進(jìn)行翻轉(zhuǎn)，將活性基團(tuán)與原二噁烷相連，轉(zhuǎn)換成與苯環(huán)相連，與此同時(shí)活性基團(tuán)由Netarsudil 的類(lèi)似活性基團(tuán)替代(圖2)。這些活性基團(tuán)包括苯甲?；?、苯乙?；被柞；鹊?，另外為了考察伯胺對(duì)活性大小的意義，還設(shè)計(jì)了伯胺被甲磺?；〈幕衔?。

圖2 目標(biāo)化合物10a-g, 13a-c 分子設(shè)計(jì)示意圖

1.2 目標(biāo)化合物的合成

化合物10a-g 按照?qǐng)D示1 的方法進(jìn)行合成。

圖示1 目標(biāo)化合物10a-g 的合成路線

用TIPS-OTf 對(duì)4-羥基苯乙酸甲酯(1)進(jìn)行保護(hù)，得到羥基被保護(hù)的中間體2 (91.3%)[12]，中間體2 與N-溴甲基鄰苯二甲酰亞胺進(jìn)行烷基化反應(yīng)，得到中間體3 (77.0%)[13]，該中間體隨后在氫氧化鋰的作用下水解甲酯鍵和亞胺環(huán)，得到中間體4 (80.0%)[14]，在DMAP 和EDCI 的存在下，中間體4 與2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-胺發(fā)生縮合反應(yīng)，得到1,4-苯并二噁烷類(lèi)似物酰胺中間體5 (68.8%)[15]，而環(huán)亞胺完好無(wú)損。中間體5 在水合肼的作用下得到伯胺中間體6 (84.5%)，隨后在Boc2O 作用下得到氨基被Boc基團(tuán)保護(hù)的中間體7 (83.0%)，用四丁基氟化銨去除硅基保護(hù)基團(tuán)，得到N-Boc 保護(hù)的苯酚中間體8(75.5%)[16]。中間體8 分別與相應(yīng)的酰氯、羧酸和鹵代烴得到中間體9a-g，隨后在三氟乙酸的作用下脫掉Boc 保護(hù)基[17]，得到目標(biāo)化合物10a-g。

化合物13a-c 按照?qǐng)D示2 的方法進(jìn)行合成。用中間體6 與甲磺酰氯發(fā)生胺基的酰化反應(yīng)得到中間體11 (75.1%)，隨后用四丁基氟化銨去除硅基保護(hù)基團(tuán)，得到胺甲磺?；谋椒又虚g體12 (78.9%)，中間體12 分別與相應(yīng)的羧酸和鹵代烴得到目標(biāo)化合物13a-c。所得目標(biāo)化合物均經(jīng)過(guò)1H NMR、13C NMR、LR MS 和HR MS 進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定確認(rèn)結(jié)構(gòu)正確，經(jīng)過(guò)LC MS 確認(rèn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均達(dá)到95%。

圖示2 目標(biāo)化合物13a-c 的合成路線

1.3 目標(biāo)化合物ROCK2 抑制活性測(cè)定

用經(jīng)典的 ROCK2 酶活性測(cè)試方法[18]，以Netarsudil 為陽(yáng)性對(duì)照品[19]，測(cè)試了目標(biāo)化合物10a-g和13a-c 的體外ROCK2 酶抑制劑活性，每個(gè)化合物IC50的測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)合化合物II 的活性結(jié)果，化合物10e 和10f 表現(xiàn)出了一定的體外ROCK2 酶抑制劑活性，其IC50達(dá)到了94.14 μM 和169.69 μM。從10a-g 和13a-c 的活性數(shù)據(jù)來(lái)看，藥效團(tuán)骨架的A環(huán)為脂肪環(huán)時(shí)活性不如芳香環(huán)；從表中可以看到13a-c 的活性不佳，說(shuō)明側(cè)鏈伯胺基被取代則活性下降，保留伯胺基團(tuán)活性增高；在10a-g 的化合物結(jié)構(gòu)中，側(cè)鏈有芳香環(huán)時(shí)的活性要明顯好于脂肪環(huán)的活性，且芳香環(huán)在3 位和6 位同時(shí)有取代基時(shí)，活性增加明顯。

表1 化合物的ROCK2 活性結(jié)果

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Bruker Ascend 400、Varian S 400 MHz 型核磁共振儀, 以CDCl3、DMSO-d6、CH3OD 為溶劑, TMS 為內(nèi)標(biāo); Shimadzu LC-20AB 型 HPLC; Agilent Technologies 1200 series 型 LCMS; Agilent 6210 time-of-fight LC/MS; Agela-FL-H600G 型Pre-HPLC。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 4-三異基硅氧基苯乙酸甲酯(2)的合成

稱(chēng)量4-羥基苯乙酸甲酯(1) 55.0 g 加入反應(yīng)瓶中，用二氯甲烷280 mL 溶解，0 °C 攪拌下加入二甲基吡啶77.1 mL，同時(shí)加入三異丙基硅基三氟甲磺酸酯97.9 mL, 于15 °C 下攪拌反應(yīng)15 h，反應(yīng)液變成黃色。TLC 顯示已達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)，加入飽和氯化銨溶液500 mL 和二氯甲烷150 mL×2 萃取，將有機(jī)層旋蒸后得到殘余物，殘余物通過(guò)柱層析(石油醚/乙酸乙酯=100/1 to 10/1)純化得到中間體(2)，淺黃色油狀物97.5 g，收率91.3%。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 7.11 (d,J= 8.38 Hz, 2 H), 6.78 (d,J=8.38 Hz, 2 H), 3.62～3.53 (m, 5 H), 1.26～1.15 (m, 3 H),1.03 (d,J= 7.28 Hz, 18 H); LCMS (ESI): calcd. for C18H30O3Si [M+H]+: 323.2; found: 323.1 [M+H]+。

2.2.2 3-(N-鄰苯二甲酰亞胺基)-2-(4-三異丙基硅氧基苯基)丙酸甲酯(3)的合成

稱(chēng)量中間體(2) 30.0 g 加入反應(yīng)瓶中，用四氫呋喃300 mL 溶解，-70 °C 攪拌下加入雙三甲基硅基胺基鋰(1M) 97.7 mL，-70 °C 攪拌1 h，加入N-溴甲基鄰苯二甲酰亞胺24.6 g，并在-70 °C 攪拌反應(yīng)2 h，反應(yīng)液變成黃色。TLC 顯示已達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)，加入飽和氯化銨溶液500 mL 和乙酸乙酯200 mL×3 萃取，有機(jī)層用飽和食鹽水150 mL 洗滌，將有機(jī)層旋蒸后得到殘余物，殘余物通過(guò)柱層析(石油醚/乙酸乙酯=100/1 to 10/1)純化得到中間體(3)，白色固體34.5 g，收率77.0%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ:7.77(d,J =0.88 Hz, 4 H), 7.08 (d,J =8.60 Hz, 2 H), 6.72 (d,J =8.60 Hz, 2 H), 4.14～4.08 (m, 1 H), 4.04～3.99 (m, 2 H), 3.58 (s, 3 H), 3.31 (s, 2 H), 1.12 (br d,J =7.50 Hz,3 H), 0.94 (dd,J =7.28, 4.85 Hz, 18 H); LCMS (ESI):calcd. for C27H35NO5Si [M+H]+: 482.2; found: 482.2[M+H]+。

2.2.3 3-(N-(2-氨甲酰苯甲酸))-2-(4-三異丙基硅氧基苯基)丙酸(4)的合成

稱(chēng)量中間體(3) 124.0 g 加入反應(yīng)瓶中，用四氫呋喃620 mL 溶解，同時(shí)稱(chēng)量氫氧化鋰一水合物27.0 g用純化水620 mL 溶解，并在20 °C 下加入到四氫呋喃溶液中，并于20 ℃攪拌反應(yīng)16 h，反應(yīng)液變成黃色。TLC 顯示已達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)，加入1 N 鹽酸500 mL調(diào)節(jié)pH 為4，用乙酸乙酯600 mL×3 萃取，有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾旋蒸后得到殘余物，殘余物通過(guò)柱層析(二氯甲烷/四氫呋喃 = 10/1 to 2/1)純化得到中間體(4)，黃色固體100.0 g，收率80.0%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ:13.00～ 12.32 (m, 2 H),8.43～8.33 (m, 1 H), 7.75～7.70 (m, 1 H), 7.52 ～7.43 (m,2 H), 7.20 (d,J =8.56 Hz, 3 H), 6.85 (d,J =8.56 Hz, 2 H), 3.90～3.82 (m, 1 H), 3.69～3.64 (m, 1 H), 3.54～3.44(m, 1 H), 1.30～1.19 (m, 3 H), 1.06 (d,J =7.34 Hz, 18 H); LCMS (ESI): calcd. for C26H35NO6Si [M+H]+: 486.2;found: 486.2 [M+H]+。

2.2.4 N-(2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-基)-3-(1,3-鄰苯二甲亞酰-2-基)-2-(4-三異丙基硅氧基苯基)丙酰胺(5)的合成

稱(chēng)量中間體(4) 47.0 g加入反應(yīng)瓶中，用吡啶235 mL 溶解，25 °C 攪拌下加入2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-胺14.6 g，繼續(xù)加入DMAP 11.8 g 和EDCI 36.9 g，并于25 °C 攪拌反應(yīng)2 h，反應(yīng)液變成紅色。TLC 顯示已達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)，將反應(yīng)液旋蒸后得到殘余物，殘余物通過(guò)柱層析(石油醚/乙酸乙酯 = 50/1 to 0/1)純化得到中間體(5)，黃色油狀物40.0 g，收率68.8%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 10.02 (s, 1H),7.80～7.71 (m, 4H), 7.17 (dd,J= 3.0, 5.6 Hz, 3H), 6.90(dd,J= 2.4, 8.8 Hz, 1H), 6.71 (dd,J= 3.4, 8.7 Hz, 3H),4.23～4.08 (m, 6H), 3.94 (dd,J= 6.5, 13.3 Hz, 1H),1.13～1.05 (m, 3H), 0.93 (dd,J= 5.5, 7.3 Hz, 18H);LCMS (ESI): calcd. for C34H40N2O6Si [M+H]+: 601.3;found: 601.3 [M+H]+。

2.2.5 N-(2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-基)-3-胺基-2-(4-三異丙基硅氧基苯基)丙酰胺(6)的合成

稱(chēng)量中間體(5) 39.0 g加入反應(yīng)瓶中，用乙醇390 mL 溶解，25 °C 攪拌下加入水合肼(98%) 6.61 g，并于80 °C 攪拌反應(yīng)12 h，反應(yīng)液變混濁。TLC 顯示已達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)，反應(yīng)液過(guò)濾后旋蒸后得到殘余物中間體(6)，白色固體29.0 g，收率84.5%。1H NMR (400 MHz, MeOD)δ: 7.25 (d,J= 8.6 Hz, 2H), 7.14 (d,J=2.4 Hz, 1H), 6.91～6.83 (m, 3H), 6.72 (d,J= 8.8 Hz,1H), 4.22～4.16 (m, 4H), 3.74 (dd,J= 5.6, 8.7 Hz, 1H),3.36～3.31 (m, 1H), 2.96 (dd,J= 5.5, 12.8 Hz, 1H),1.30～1.21 (m, 3H), 1.09 (d,J= 7.3 Hz, 18H)。

2.2.6 N-(2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-基)-3-(叔丁氧羰基胺基)-2-(4-三異丙基硅氧基苯基)丙酰胺(7)的合成

稱(chēng)量中間體(6) 28.0 g 加入反應(yīng)瓶中，用二氯甲烷140 mL 溶解，25 °C 攪拌下加入Boc2O15.6 g，并于25 °C 攪拌反應(yīng)2 h，反應(yīng)液變混濁。TLC 顯示已達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)，反應(yīng)液過(guò)濾旋蒸后得到殘余物，殘余物通過(guò)柱層析(石油醚/乙酸乙酯 = 50/1 to 0/1)純化得到中間體(7)，白色固體29.0 g，收率83.01%。1H NMR (400 MHz, CH3OD)δ: 7.26 (br d,J =8.4 Hz, 2H),7.13 (d,J =2.4 Hz, 1H), 6.92～6.80 (m, 3H), 6.74 ～6.69(m, 1H), 4.23～4.16 (m, 4H), 3.84 (dd,J =6.2, 8.6 Hz,1H), 3.61～3.52 (m, 1H), 3.43～3.34 (m, 1H), 1.40 (s,8H), 1.28～1.21 (m, 3H), 1.10 (d,J =7.3 Hz, 18H);LCMS (ESI): calcd. for C31H46N2O6Si [M+H]+: 571.3;found : 571.5[M+H]+。

2.2.7 N-(2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-基)-3-(叔丁氧羰基胺基)-2-(4-羥基苯基)丙酰胺(8)的合成

稱(chēng)量中間體(7) 18.0 g 加入反應(yīng)瓶中，用四氫呋喃90 mL 溶解，0 °C 攪拌下加入四丁基氟化銨(1M)31.5 mL，并于0 °C 攪拌反應(yīng)0.5 h，反應(yīng)液變成紅色。TLC 顯示已達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)，加入乙酸乙酯200 mL，用純化水100 mL×3 萃取，有機(jī)層旋蒸后得到殘余物，殘余物通過(guò)柱層析(石油醚/乙酸乙酯 = 50/1 to 0/1)純化得到中間體(8)，類(lèi)白色固體10.0 g，收率75.5%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ:9.85 (s, 1H),9.28 (s, 1H), 7.22 (d,J= 2.4 Hz, 1H), 7.11 (d,J= 8.4 Hz, 2H), 6.93 (dd,J= 2.4, 8.6 Hz, 1H), 6.84 (br t,J=5.4 Hz, 1H), 6.69 (dd,J= 8.5, 16.0 Hz, 3H), 4.16 (q,J=4.9 Hz, 4H), 3.76 (br t,J= 7.5 Hz, 1H), 3.44～3.36 (m,1H), 3.15 (td,J= 6.3, 13.0 Hz, 1H), 1.33 (s, 9H); LCMS(ESI): calcd. for C22H26N2O6[M+H]+: 415.2; found:415.1[M+H]+。

2.2.8 N-(2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-基)-3-胺基-2-(4-(4-硝基苯甲酰氧基)苯基)丙酰胺(10a)的合成

稱(chēng)量中間體(8) 850 mg 加入反應(yīng)瓶中，用二氯甲烷/吡啶(10/1) 20 mL 溶解，25 °C 攪拌下加入三乙胺608 mg 和DMAP25.0 mg，并加入4-硝基苯甲酰氯483 mg，并于40 °C 攪拌反應(yīng)15 h，TLC 顯示已達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)，加入飽和碳酸氫鈉20 mL，用二氯甲烷40 mL 萃取，有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾旋蒸得到殘余物，殘余物通過(guò)柱層析(石油醚/乙酸乙酯= 5/1 to 0/1)純化得到中間體(9a)，直接用于下步反應(yīng)。

將得到的中間體(9a)加入反應(yīng)瓶中，0 °C 攪拌下加入三氟乙酸2 mL，并于15 °C 攪拌反應(yīng)3 h，LC-MS顯示原料已反應(yīng)完，且發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物(10a)，加入飽和碳酸氫鈉10 mL，用二氯甲烷15 mL×3 萃取，有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾旋蒸得到殘余物，殘余物通過(guò)制備型HPLC 得到目標(biāo)產(chǎn)物(10a)，淺黃色固體36 mg，收率13.8%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ:10.20 (s, 1H), 8.43 (m,J= 8.8 Hz, 2H), 8.36 (m,J= 8.8 Hz, 2H), 7.98 (br s, 3H), 7.50 (m,J= 8.8 Hz, 2H), 7.38(m,J= 8.4 Hz, 2H), 7.28 (d,J= 2.4 Hz, 1H), 6.98 (dd,J= 8.8, 2.4 Hz, 1H), 6.79 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 4.13～4.27(m, 4H), 4.05 (dd,J= 9.2, 5.2 Hz, 1H), 3.48～3.55 (m,1H), 3.07～3.17 (m, 1H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d6)δ: ppm 168.68 (s, 1 C), 163.59 (s, 1 C), 151.13 (s, 1 C),150.41 (s, 1 C), 143.41 (s, 1 C), 140.10 (s, 1 C), 135.41(s, 1 C), 134.86 (s, 1 C), 132.89 (s, 1 C), 131.76 (s, 1 C),129.54 (s, 1 C), 124.50 (s, 1 C), 122.67 (s, 1 C), 117.23(s, 1 C), 113.12 (s, 1 C), 109.12 (s, 1 C), 64.67 (s, 1 C),64.43 (s, 1 C), 49.58 (s, 1 C), 41.50 (s, 1 C); LCMS[M-H]+= 462.1; HR-MS calcd. for C24H21N3O7[M+H]+:464.1; found: 464.148 10 [M+H]+。

2.2.9 N-(2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-基)-3-胺基-2-(4-(4-甲基哌嗪甲酰氧基)苯基)丙酰胺(10b)的合成

稱(chēng)量中間體(8) 100 mg 加入反應(yīng)瓶中，用二氯甲烷3 mL 溶解，25 °C 攪拌下加入三乙胺146 mg 和DMAP2.95 mg，并加入4-甲基哌嗪甲酰氯102 mg，并于40 °C 攪拌反應(yīng)15 h，TLC 顯示已達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)，加入飽和碳酸氫鈉10 mL，用二氯甲烷30 mL 萃取，有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾旋蒸得到殘余物，殘余物通過(guò)柱層析(石油醚/乙酸乙酯= 5/1 to 0/1)純化得到中間體(9b)，直接用于下步反應(yīng)。

將得到的中間體(9b)加入反應(yīng)瓶中，0 °C 攪拌下加入三氟乙酸3 mL，并于15 °C 攪拌反應(yīng)2 h，LC-MS 顯示原料已反應(yīng)完，且發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物(10b)，加入飽和碳酸氫鈉10 mL，用二氯甲烷15 mL×3 萃取，有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾旋蒸得到殘余物，殘余物通過(guò)制備型HPLC 得到目標(biāo)產(chǎn)物(10b)，無(wú)色油狀物36 mg，收率43.7%。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ:10.19 (s, 1H), 8.00 (br s, 3H), 7.41 (m,J=8.4 Hz, 2H), 7.26 (d,J= 2.4 Hz, 1H), 7.17 (m,J= 8.4 Hz, 2H), 6.96 (dd,J= 8.8, 2.4 Hz, 1H), 6.77 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 4.14～4.24 (m, 4H), 4.01 (br dd,J= 9.2, 5.2 Hz,1H), 3.30～3.52 (m, 9H), 3.06 (br d,J= 9.4 Hz, 1H),2.83 (s, 3H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d6)δ: ppm 168.73 (s, 1 C), 152.98 (s, 1 C), 150.91 (s, 1 C), 143.37(s, 1 C), 140.03 (s, 1 C), 134.57 (s, 1 C), 132.92 (s, 1 C),129.19 (s, 1 C), 122.59 (s, 1 C), 117.21 (s, 1 C), 113.07(s, 1 C), 109.06 (s, 1 C), 64.65 (s, 1 C), 64.41 (s, 1 C),52.41 (s, 1 C), 49.50 (s, 1 C), 42.85 (s, 1 C), 41.47 (s, 1 C), 40.66～40.70 (m, 1 C); LCMS [M+H]+= 441.1;HR-MS calcd. for C23H28N4O5[M+H]+: 441.2; found:441.201 84 [M+H]+。

2.2.10 N-(2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-基)-3-胺基-2-(4-(N-乙基甲基氨基甲酰氧基)苯基)丙酰胺(10c)的合成

稱(chēng)量中間體(8) 150 mg 加入反應(yīng)瓶中，用二氯甲烷3 mL 溶解，25 °C 攪拌下加入三乙胺110 mg 和DMAP4.42 mg，并加入N-乙基甲基氨基甲酰氯66.0 mg，并于40 °C 攪拌反應(yīng)12 h，TLC 顯示已達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)，加入飽和碳酸氫鈉10 mL，用二氯甲烷30 mL萃取，有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾旋蒸得到殘余物，殘余物通過(guò)柱層析(石油醚/乙酸乙酯 = 5/1 to 0/1)純化得到中間體(9c)，直接用于下步反應(yīng)。將得到的中間體(9c)加入反應(yīng)瓶中，0 °C 攪拌下加入二氯甲烷5 mL 溶解，將三氟乙酸0.5 mL 和二氯甲烷4.5 mL 的混合溶液滴加到上述溶液中，并于15 °C 攪拌反應(yīng)5 h，LC-MS 顯示原料已反應(yīng)完，且發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物(10c)，加入飽和碳酸氫鈉10 mL，用二氯甲烷15 mL×3 萃取，有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾旋蒸得到殘余物，殘余物通過(guò)制備型HPLC 得到目標(biāo)產(chǎn)物(10c)，白色固體31 mg，收率15.5%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ:9.94～10.08 (m, 1H), 7.34(m,J= 8.4 Hz, 2H), 7.27 (d,J= 2.4 Hz, 1H), 7.06 (m,J= 8.4 Hz, 2H), 6.97 (dd,J= 8.8, 2.4 Hz, 1H), 6.75 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 4.19 (q,J= 4.8 Hz, 4H), 3.65 (dd,J= 8.8,5.36 Hz, 1H), 3.40 (q,J= 6.8 Hz, 1H), 3.29 (q,J=6.8Hz, 1H), 3.17 (br dd,J= 12.0, 9.2 Hz, 1H), 3.00 (s,2H), 2.88 (s, 3H), 2.78 (br dd,J= 12.4, 5.2 Hz, 1H),1.01～1.20 (m, 3H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d6)δ:ppm 171.08 (s, 1 C), 154.10 (br d,J=10.90 Hz, 1 C),150.63 (s, 1 C), 143.34 (s, 1 C), 139.69 (s, 1 C), 136.34(s, 1 C), 133.37 (s, 1 C), 128.98 (s, 1 C), 122.19 (s, 1 C),117.13 (s, 1 C), 112.86 (s, 1 C), 108.79 (s, 1 C), 64.64 (s,1 C), 64.38 (s, 1 C), 55.85 (s, 1 C), 45.97 (s, 1 C), 43.92(s, 1 C), 34.18 (br d,J=34.88 Hz, 1 C), 13.11 (br d,J=79.20 Hz, 1 C); LCMS [M+H]+= 400.1; HR-MS calcd.for C21H25N3O5[M+H]+: 400.2; found: 400.185 53[M+H]+。

2.2.11 N-(2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-基)-3-胺基-2-(4-(3-硝基苯乙酰氧基)苯基)丙酰胺(10d)的合成

稱(chēng)量中間體(8) 150 mg 和3-硝基苯乙酸78.6 mg加入反應(yīng)瓶中，用吡啶2 mL 溶解，0 °C 攪拌滴加三氯氧磷55.5 mg，并于15 °C 攪拌反應(yīng)12 h，TLC顯示已達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)，加入飽和碳酸氫鈉2 mL，用二氯甲烷30 mL×3 萃取，有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾旋蒸得到中間體(9d)，直接用于下步反應(yīng)。

將得到的中間體(9d)加入反應(yīng)瓶中，0 °C 攪拌下加入二氯甲烷5 mL 溶解，將三氟乙酸0.5 mL 和二氯甲烷4.5 mL 的混合溶液滴加到上述溶液中，并于15 °C 攪拌反應(yīng)5 h，LC-MS 顯示原料已反應(yīng)完，且發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物(10d)，加入飽和碳酸氫鈉10 mL，用二氯甲烷15 mL×3 萃取，有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾旋蒸得到殘余物，殘余物通過(guò)制備型HPLC 得到目標(biāo)產(chǎn)物(10d)，淺黃色固體20 mg，收率9.23%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ:10.16 (s, 1H),8.26～8.37 (m, 1H), 8.18 (br d,J= 8.4 Hz, 1H), 7.95 (br s, 3H), 7.86 (br d,J= 7.6 Hz, 1H), 7.67 (t,J= 8.0 Hz,1H), 7.43 (d,J= 8.4 Hz, 2H), 7.13～7.30 (m, 3H), 6.95(dd,J= 8.8, 2.4 Hz, 1H), 6.77 (d,J= 8.8 Hz, 1H),4.14～4.26 (m, 6 H), 4.00 (br dd,J= 8.8, 5.2 Hz, 1H),3.48 (br s, 1H), 3.00～3.15 (m, 1H);13C NMR (101 MHz,DMSO-d6)δ: ppm 169.99 (s, 1 C), 168.68 (s, 1 C),150.45 (s, 1 C), 148.24 (s, 1 C), 143.39 (s, 1 C), 140.07(s, 1 C), 137.07 (s, 1 C), 136.62 (s, 1 C), 135.02 (s, 1 C),132.87 (s, 1 C), 130.30 (s, 1 C), 129.43 (s, 1 C), 124.93(s, 1 C), 122.58 (s, 1 C), 117.21 (s, 1 C), 113.10 (s, 1 C),109.10 (s, 1 C), 64.65 (s, 1 C), 64.41 (s, 1 C), 49.52 (s, 1 C), 41.50 (s, 1 C), 40.69～40.75 (m, 1 C); LCMS [M+H]+= 478.0; HR-MS calcd. for C25H23N3O7[M+H]+: 478.1;found: 478.159 05 [M+H]+。

2.2.12 N-(2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-基)-3-胺基-2-(4-(3-硝基-6-甲氧基苯甲氧基)苯基)丙酰胺(10e)的合成

稱(chēng)量中間體(8) 150 mg 加入反應(yīng)瓶中，用乙腈30 mL 溶解，25 °C 攪拌下加入3-硝基-6-甲氧基芐基溴93.5 mg 和碳酸鉀55.0 mg，并于40 °C 攪拌反應(yīng)12 h，TLC 顯示已達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)，加入乙酸乙酯50 mL 后過(guò)濾，濾液旋蒸得到中間體(9e)，直接用于下步反應(yīng)。

將得到的中間體(9e)加入反應(yīng)瓶中，0 °C 攪拌下加入二氯甲烷5.0 mL 溶解，將三氟乙酸1.0 mL 和二氯甲烷4.0 mL 的混合溶液滴加到上述溶液中，并于15 °C 攪拌反應(yīng)12 h，LC-MS 顯示原料已反應(yīng)完，且發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物(10e)，加入飽和碳酸氫鈉10 mL，用二氯甲烷15 mL×3 萃取，有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾旋蒸得到殘余物，殘余物通過(guò)制備型HPLC 得到目標(biāo)產(chǎn)物(10e)，類(lèi)白色固體53 mg，收率26.2%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ:10.10 (s, 1H), 8.28 (br s, 2H), 7.93 (br s, 3H), 7.32 (br d,J= 8.8 Hz, 2H), 7.27(br d,J= 12.4 Hz, 1H), 7.07 (br d,J= 8.4 Hz, 2H),6.88～7.01 (m, 1H), 6.77 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 5.12 (s,2H), 4.19 (br d,J= 4.0 Hz, 4H), 3.90～ 4.04 (m, 4H),3.46 (br s, 1H), 3.05 (br s, 1H);13C NMR (101 MHz,DMSO-d6)δ: ppm 169.10 (s, 1 C), 162.42 (s, 1 C),158.16 (s, 1 C), 143.35 (s, 1 C), 141.09 (s, 1 C), 139.95(s, 1 C), 133.01 (s, 1 C), 129.89 (s, 1 C), 129.50 (s, 1 C),126.63 (s, 1 C), 126.15 (s, 1 C), 124.21 (s, 1 C), 117.20(s, 1 C), 115.53 (s, 1 C), 112.99 (s, 1 C), 111.99 (s, 1 C),108.97 (s, 1 C), 64.64 (s, 1 C), 64.40 (s, 1 C), 64.32 (s, 1 C), 57.18 (s, 1 C), 49.30 (s, 1 C), 41.55 (s, 1 C); LCMS[M+H]+=480.2; HR-MS calcd. for C25H25N3O7[M+H]+:480.1; found: 480.163 90 [M+H]+。

2.2.13 N-(2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-基)-3-胺基-2-(4-(3-氟苯甲氧基)苯基)丙酰胺(10f)的合成

稱(chēng)量中間體(8) 150 mg 加入反應(yīng)瓶中，用四氫呋喃10 mL溶解，25 °C 攪拌下加入3-氟芐基溴68.4 mg和碳酸銫124 mg，并于40 °C 攪拌反應(yīng)12 h，TLC顯示已達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)，加入乙酸乙酯50 mL 后過(guò)濾，濾液旋蒸得到中間體(9f)，直接用于下步反應(yīng)。

將得到的中間體(9f)加入反應(yīng)瓶中，0 °C 攪拌下加入二氯甲烷5.0 mL 溶解，將三氟乙酸0.5 mL 和二氯甲烷4.5 mL 的混合溶液滴加到上述溶液中，并于15 °C 攪拌反應(yīng)5 h，LC-MS 顯示原料已反應(yīng)完，且發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物(10f)，加入飽和碳酸氫鈉10 mL，用二氯甲烷15 mL×3 萃取，有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾旋蒸得到殘余物，殘余物通過(guò)制備型HPLC 得到目標(biāo)產(chǎn)物(10f)，白色固體120 mg，收率57.6%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ:9.94 (br d,J= 10.0 Hz,1H), 7.39～7.47 (m, 1H), 7.22～7.32 (m, 5H), 7.07～7.18(m, 1H), 6.97 (br d,J= 8.8 Hz, 3H), 6.75 (d,J= 8.8 Hz,1H), 5.10 (s, 2H), 4.19 (q,J= 4.8 Hz, 4H), 3.58 (br dd,J= 8.8, 5.50 Hz, 1H), 3.14 (br dd,J= 12.4, 9.2 Hz, 1H),2.68 (br s, 3H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d6)δ: ppm 171.41 (s, 1 C), 163.88 (s, 1 C), 161.45 (s, 1 C), 157.54(s, 1 C), 143.32 (s, 1 C), 140.66 (s, 1 C), 140.59 (s, 1 C),139.62 (s, 1 C), 133.46 (s, 1 C), 132.06 (s, 1 C), 130.96(s, 1 C), 130.88 (s, 1 C), 129.31 (s, 1 C), 123.88 (s, 1 C),123.85 (s, 1 C), 117.12 (s, 1 C), 115.15 (s, 1 C), 112.79(s, 1 C), 108.71 (s, 1 C), 68.81 (s, 1 C), 64.63 (s, 1 C),64.38 (s, 1 C), 55.68 (s, 1 C), 45.95 (s, 1 C); LCMS[M+H]+= 423.1; HR-MS calcd. for C24H23N2O4[M+H]+:423.2; found:423.172 72 [M+H]+。

2.2.14 N-(2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-基)-3-胺基-2-(4-環(huán)丙基甲氧基苯基)丙酰胺(10g)的合成

稱(chēng)量中間體(8) 150 mg 加入反應(yīng)瓶中，用乙腈40 mL 溶解，25 °C 攪拌下加入溴甲基環(huán)丙烷58.6 mg和碳酸銫177 mg，并于40 °C 攪拌反應(yīng)12 h，TLC顯示已達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)，加入乙酸乙酯50 mL 后過(guò)濾，濾液旋蒸得到中間體(9g)，直接用于下步反應(yīng)。

將得到的中間體(9g)加入反應(yīng)瓶中，0 °C 攪拌下加入二氯甲烷5.0 mL 溶解，將三氟乙酸1.0 mL 和二氯甲烷4.0 mL 的混合溶液滴加到上述溶液中，并于15 °C 攪拌反應(yīng)12 h，LC-MS 顯示原料已反應(yīng)完，且發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物(10g)，加入飽和碳酸氫鈉10 mL，用二氯甲烷15 mL×3 萃取，有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾旋蒸得到殘余物，殘余物通過(guò)制備型HPLC 得到目標(biāo)產(chǎn)物(10g)，類(lèi)白色固體50 mg，收率25.4%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ:9.92 (br s, 1H),7.17～7.31 (m, 3H), 6.91～7.01 (m, 1H), 6.87 (br d,J=8.4 Hz, 2H), 6.75 (br d,J= 8.8 Hz, 1H), 4.19 (br d,J=4.4 Hz, 4H), 3.77 (br d,J= 6.8 Hz, 2H), 3.56 (br dd,J=8.4, 5.6 Hz, 1H), 2.98～3.24 (m, 3H), 2.66～2.79 (m, 1H),1.12～1.34 (m, 1H), 0.55 (br d,J= 7.2 Hz, 2H), 0.29 (br d,J= 4.4 Hz, 2H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d6)δ:ppm 171.39 (s, 1 C), 158.05 (s, 1 C), 143.31 (s, 1 C),139.59 (s, 1 C), 133.48 (s, 1 C), 131.35 (s, 1 C), 129.22(s, 1 C), 117.14 (s, 1 C), 114.78 (s, 1 C), 112.74 (s, 1 C),108.65 (s, 1 C), 72.40 (s, 1 C), 64.64 (s, 1 C), 64.37 (s, 1 C), 55.47 (s, 1 C), 45.80 (s, 1 C), 10.63 (s, 1 C), 3.56 (s,1 C); LCMS [M+H]+= 369.1; HR-MS calcd. for C21H24N2O4[M+H]+: 369.2; found: 369.164 93 [M+H]+。

2.2.15 N-(2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-基)-3-甲磺酰胺基-2-(4-三異丙基硅氧基苯基)丙酰胺(11)的合成

稱(chēng)量中間體(6) 6.0 g 和三乙胺1.44 g 加入反應(yīng)瓶中，用二氯甲烷60 mL 溶解，10 °C 攪拌下滴加甲磺酰氯1.30 g，并于25 °C 攪拌反應(yīng)12 h，TLC 顯示已達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)，將反應(yīng)液旋蒸后得到殘余物，殘余物通過(guò)柱層析(石油醚/乙酸乙酯 = 5/1 to 0/1)純化得到中間體(11)，黃色固體3.90 g，收率75.1%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 9.98 (s, 1H), 7.11～7.27(m, 4H), 6.96 (dd,J= 8.8, 2.4 Hz, 1H), 6.79 ～6.87 (m,2H), 6.68～6.77 (m, 1H), 4.15～4.21 (m, 4H), 3.75～3.79(m, 1H), 3.52～3.60 (m, 1H), 3.12～3.17 (m, 1H),3.01～3.02 (m, 1H), 2.83 (s, 3H), 1.18～1.26 (m, 3H),1.04 (d,J= 7.2 Hz, 18H)。

2.2.16 N-(2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-基)-3-甲磺酰胺基-2-(4-羥基苯基)丙酰胺(12)的合成

稱(chēng)量中間體(11) 3.9 g 加入反應(yīng)瓶中，用四氫呋喃40 mL 溶解，0 °C 攪拌下滴加四丁基氟化銨(1M)7.11 mL，并于0 °C 攪拌反應(yīng)0.5 h，TLC 顯示已達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)，反應(yīng)液用乙酸乙酯200 mL 和純化水50 mL 萃取，有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾旋蒸后得到殘余物，殘余物通過(guò)柱層析(石油醚/乙酸乙酯 = 5/1 to 0/1)純化得到中間體(12)，白色固體2.2 g，收率78.9%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 9.93(s, 1H), 9.35 (s, 1H), 7.25 (d,J= 2.4 Hz, 1H), 7.12～7.19 (m, 3H), 6.96 (dd,J= 8.8, 2.4 Hz, 1H), 6.74 (br d,J= 8.8 Hz, 1H), 6.71 (br d,J= 8.4 Hz, 2H), 4.14～4.22(m, 4H), 3.72 (dd,J= 9.2, 5.6 Hz, 1H), 3.54 (ddd,J=13.2, 9.2, 6.0 Hz, 1H), 3.06～3.15 (m, 1H), 2.83 (s, 3H)。

2.2.17 N-(2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-基)-3-甲磺酰胺基-2-(4-(4-硝基苯甲酰氧基)苯基)丙酰胺(13a)的合成

稱(chēng)量中間體(12) 100 mg 和4-硝基苯甲酸55.4 mg 加入反應(yīng)瓶中，用吡啶2 mL 溶解，0 °C 攪拌下滴加三氯氧磷78.2 mg，并于0 °C 攪拌反應(yīng)3 h，LC-MS 顯示原料已反應(yīng)完，且發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物(13a)，加入飽和碳酸氫鈉2 mL，用乙酸乙酯20 mL 萃取，有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾旋蒸得到殘余物，殘余物通過(guò)制備型HPLC 得到目標(biāo)產(chǎn)物(13a)，黃色固體28.0 mg，收率19.6%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ:10.11 (br s, 1H), 8.29～8.49 (m, 4H), 7.49 (br d,J= 7.6 Hz, 2H), 7.21～7.42 (m, 4H), 6.99 (br d,J= 8.0 Hz, 1H),6.77 (br d,J= 8.4 Hz, 1H), 4.20 (br s, 4H), 3.95 (br s,1H), 3.64 (br s, 1H), 3.15～3.27 (m, 1H), 2.88 (br s, 3H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d6)δ: ppm 169.78 (s, 1 C),163.65 (s, 1 C), 151.09 (s, 1 C), 150.04 (s, 1 C), 143.38(s, 1 C), 139.88 (s, 1 C), 136.52 (s, 1 C), 134.88～134.95(m, 1 C), 133.17 (s, 1 C), 131.76 (s, 1 C), 129.51 (s, 1 C),124.47 (s, 1 C), 122.28 (s, 1 C), 117.20 (s, 1 C), 112.89(s, 1 C), 108.83 (s, 1 C), 64.65 (s, 1 C), 64.40 (s, 1 C),52.69 (s, 1 C), 45.35～46.15 (m, 1 C), 40.69～40.75 (m, 1 C); LCMS [M-H]+=540.1; HR-MS calcd. for C25H23N3O9S[M-H]+: 540.1; found: 540.109 73 [M-H]+。

2.2.18 N-(2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-基)-3-甲磺酰胺基-2-(4-(4-硝基苯乙酰氧基)苯基)丙酰胺(13b)的合成

稱(chēng)量中間體(12) 100 mg 和4-硝基苯乙酸60.0 mg 加入反應(yīng)瓶中，用吡啶2 mL 溶解，0 °C 攪拌下滴加三氯氧磷78.2 mg，并于0 °C 攪拌反應(yīng)2 h，反應(yīng)液變成棕色，LC-MS 顯示原料已反應(yīng)完，且發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物(13b)，加入飽和碳酸氫鈉2 mL，用乙酸乙酯20 mL 萃取，有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾旋蒸得到殘余物，殘余物通過(guò)制備型HPLC 得到目標(biāo)產(chǎn)物(13b)，黃色固體28.0 mg，收率19.8%。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ:10.06 (s, 1H), 8.24 (m,J= 8.8 Hz, 2H), 7.68 (m,J= 8.4 Hz, 2H), 7.42 (m,J= 8.4 Hz,2H), 7.25 (br d,J= 2.0 Hz, 2H), 7.09～7.20 (m, 2H),6.96 (dd,J= 8.8, 2.0 Hz, 1H), 6.76 (d,J= 8.8 Hz, 1H),4.12～4.24 (m, 6H), 3.89 (br dd,J= 8.8, 6.0 Hz, 1H),3.55～3.67 (m, 1H), 3.16～3.27 (m, 1H), 2.85 (s, 3H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d6)δ: ppm 169.78 (s, 1 C),169.74 (s, 1 C), 150.04 (s, 1 C), 147.18 (s, 1 C), 143.36(s, 1 C), 142.31 (s, 1 C), 139.86 (s, 1 C), 136.14 (s, 1 C),133.15 (s, 1 C), 131.51 (s, 1 C), 129.40 (s, 1 C), 123.93(s, 1 C), 122.18 (s, 1 C), 117.19 (s, 1 C), 112.86 (s, 1 C),108.80 (s, 1 C), 64.64 (s, 1 C), 64.39 (s, 1 C), 52.66 (s, 1 C), 45.71 (s, 1 C), 40.69～40.75 (m, 1 C); LCMS [M-H]+= 554.0; HR-MS calcd. for C26H25N3O9S [M+H]+: 556.1;found: 556.138 19 [M+H]+。

2.2.19 N-(2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-基)-3-甲磺酰胺基-2-(4-環(huán)丙甲氧基苯基)丙酰胺(13c)的合成

稱(chēng)量中間體(12) 150 mg 加入反應(yīng)瓶中，用乙腈40.0 mL 溶解，25 °C 攪拌下加入溴甲基環(huán)丙烷61.9 mg 和碳酸銫187 mg，并于40 °C 攪拌反應(yīng)12 h，LC-MS 顯示原料已反應(yīng)完，且發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物(13c)，反應(yīng)液中加入乙酸乙酯20 mL，過(guò)濾旋蒸得到殘余物，殘余物通過(guò)制備型HPLC 得到目標(biāo)產(chǎn)物(13c)，白色固體31.0 mg，收率18.0%。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ:9.96 (s, 1H), 7.15～7.32 (m, 4H),6.82～6.99 (m, 3H), 6.74 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 4.18 (q,J=4.8 Hz, 4H), 3.71～3.84 (m, 3H), 3.42～3.65 (m, 1H),3.09～3.19 (m, 1H), 2.84 (s, 3H), 1.13～1.26 (m, 1H),0.48～0.61 (m, 2H), 0.24～0.35 (m, 2H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d6)δ: ppm 170.28 (s, 1 C), 158.33 (s, 1 C),143.32 (s, 1 C), 139.70 (s, 1 C), 133.32 (s, 1 C), 130.24(s, 1 C), 129.27 (s, 1 C), 117.19 (s, 1 C), 114.90 (s, 1 C),112.72 (s, 1 C), 108.64 (s, 1 C), 72.44 (s, 1 C), 64.63 (s,1 C), 64.37 (s, 1 C), 52.44 (s, 1 C), 45.77 (s, 1 C), 39.81～39.87 (m, 1 C), 10.61 (s, 1 C), 3.55 (s, 1 C); LCMS[M+H]+= 447.2; HR-MS calcd. for C22H26N2O6S [M+H]+:447.2; found: 447.161 70 [M+H]+。

2.2.20 化合物ROCK2 活性測(cè)定

利用Echo 移液系統(tǒng)進(jìn)行化合物稀釋?zhuān)衔锲鹗紳舛葹?0 μM，4 倍梯度稀釋?zhuān)?1 個(gè)濃度點(diǎn)，每個(gè)濃度兩個(gè)重復(fù)，按照預(yù)先設(shè)計(jì)的布局，用Echo移液系統(tǒng)將每個(gè)濃度的化合物中的100 nL 轉(zhuǎn)移到檢測(cè)板相應(yīng)的孔中，在1 000 r·min-1下離心15 s。用40 mM Tris,7.5、20 mM MgCl2、0.1 mg·mL-1BSA 和50 μm DTT 配制ROCK2 激酶緩沖液。用激酶緩沖液準(zhǔn)備含0.4 μg·μL-1S6K 底物和20 μM ATP 的混合液，加2.5 nL 的混合液到實(shí)驗(yàn)板相應(yīng)孔中，振蕩實(shí)驗(yàn)板15 s，在1 000 r·min-1下離心15 s。用激酶緩沖液稀釋ROCK2 酶濃度至0.12 μg·mL-1，將該ROCK2 酶溶液2.5 μL 到實(shí)驗(yàn)板相應(yīng)孔(5 μL 反應(yīng)體系中終濃度為0.3 ng ROCK2, 10 μM ATP 和 0.2 μg·μL-1S6K 底物)。室溫23 ℃下，孵育60 min。加5 μL ADP-Glo? 試劑至實(shí)驗(yàn)板相應(yīng)孔中, 振蕩實(shí)驗(yàn)板15 s，然后1 000 r·min-1，離心15 s，將實(shí)驗(yàn)板置于23 ℃ 孵育40 min。加入10 uL 激酶檢測(cè)試劑，振蕩實(shí)驗(yàn)板15 s，然后1 000 r·min-1，離心15 s，將實(shí)驗(yàn)板置于23 ℃ 孵育30 min。Envision 讀取實(shí)驗(yàn)板的發(fā)光信號(hào)，并加以分析。

3 結(jié)論

根據(jù)本研究的活性數(shù)據(jù)，總結(jié)目標(biāo)化合物ROCK2 活性構(gòu)效關(guān)系如下：1）由于10a-d、10g 和13a-c 化合物的ROCK2 抑制劑活性一般，同時(shí)參考Netarsudil 和化合物II，說(shuō)明在藥效團(tuán)的骨架結(jié)構(gòu)中A 環(huán)為脂肪環(huán)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致活性下降的非常明顯，A環(huán)為芳香環(huán)時(shí)會(huì)保持較高的活性；2）B 環(huán)為脂肪環(huán)時(shí)同樣會(huì)導(dǎo)致活性的下降，B 環(huán)為芳香環(huán)時(shí)活性較好，藥效團(tuán)的A 環(huán)和B 環(huán)，最好為兩個(gè)相鄰的芳香環(huán)組成，與靶點(diǎn)蛋白形成疏水作用，會(huì)具有很好的ROCK2 抑制劑活性；3）化合物13a-c 的伯胺被甲磺?；〈蟮幕钚砸话?，說(shuō)明化合物的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)中，最好有伯胺基團(tuán)，其氨基上的氫可以和靶點(diǎn)蛋白形成較強(qiáng)的氫鍵，使活性增高；4）側(cè)鏈中含有芳香環(huán)的10e 和10f 具有一定的活性，而脂肪環(huán)10b、10c 和10g 的活性結(jié)果一般，說(shuō)明側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)中最好有一個(gè)芳香環(huán)，且該芳香環(huán)在3 位和6 位有取代基的話，會(huì)增強(qiáng)活性。本研究結(jié)果同時(shí)顯示化合物10e 和10f 表現(xiàn)出了一定的體外ROCK2 酶抑制劑活性。接下來(lái)的研究會(huì)進(jìn)一步按照該構(gòu)效關(guān)系，以化合物10e 和10f 為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)新的藥效團(tuán)骨架，試圖找到具備有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)價(jià)值的可用于治療青光眼的新型ROCK2 抑制劑。