徐銳峰，楊威，王劍冰，趙鳴雁

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學科，黑龍江 哈爾濱 150000)

膿毒癥是一種危及生命的綜合癥，其特征是由致病菌、真菌或病毒引起的過度性全身炎癥反應[1-2]。嚴重膿毒癥患者通常表現為微血管血栓和多器官功能障礙[3]。急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是一種由多種急性低氧性呼吸衰竭疾病組成的臨床綜合征，已成為嚴重膿毒癥最常見的并發(fā)癥之一[4]。膿毒癥誘導ALI是一種急性炎癥過程，同時產生炎癥細胞因子和趨化因子。如 ALI患者的支氣管肺泡灌洗液中發(fā)現了白細胞介素-1β (IL-1β)[5]。ALI進展的另一個關鍵步驟是肺泡上皮細胞的廣泛凋亡，是ALI患者肺上皮細胞死亡的主要原因[6]。因此，阻斷肺部炎癥反應和凋亡信號傳導可能是改善膿毒癥誘導的ALI的有效治療策略。MicroRNAs (miRNAs)是一類小的非編碼RNA，在許多病理過程中表現出了新興的調節(jié)作用，包括膿毒癥誘導的器官功能障礙[7]。研究[8]發(fā)現miR-146a過表達通過抑制NF-kB的激活和炎癥細胞因子的表達，在體外減輕膿毒癥引發(fā)的心肌功能障礙。miR-27a通過抑制NF-kB/TAB3信號通路，介導紫杉醇對膿毒癥小鼠受損肝臟的保護作用[9]。研究[10]表明miR-145-5p在肺損傷組織中異常表達可能在ALI的發(fā)展中具有潛在作用，但miR-145-5p在ALI中的具體機制仍清楚。本研究通過小鼠膿毒癥模型和原代小鼠肺微血管內皮細胞，研究miR-145-5p在膿毒癥誘導ALI中的調控作用和潛在分子機制，旨在為膿毒癥誘導的ALI的治療提供一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

水合氯醛(Sigma-Aldrich，St.Louis，MI，USA)；線性聚乙烯亞胺(PEI)納米顆粒(Sigma-Aldrich，USA)；胎牛血清(FBS；Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA，USA)；Lipofectamine?2000 (Thermo Fisher Scientific，Inc.)；脂多糖(Sigma-Aldrich，USA)；熒光素酶檢測試劑盒(Promega，USA)； miRVanaTM miRNA分離試劑盒(Invitrogen)；All-in-OneTM miRNA RT-qPCR Detection Kit (GeneCopoeiaInc.，Rockville，MD，USA) ；ReverTra Ace qPCR RT試劑盒提取總RNA (Toyobo，Osaka，Japan)；7300 Real-Time PCR系統(tǒng)(Applied Biosystem，Foster City，CA，USA)；BD FACS流式細胞儀分析細胞凋亡率(BD Biosciences，San Jose，CA，USA)；RIA裂解緩沖液(PRO-PREPTM，iNtRON Biotechnology，Korea)；AlphalmagerTM 2000成像系統(tǒng)(Alpha Innotech，San Leandro，CA，USA)。

1.2 膿毒癥小鼠模型和質粒DNA的體內傳導

選取24只成年雄性SPF級C57BL/6小鼠(28～32)g，平均(30±2)g，購買自中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所動物實驗中心，飼養(yǎng)于23～25 ℃、相對濕度45%～60%及光照12 h的環(huán)境中，并可隨意獲得食物和水，適應性飼養(yǎng)一周。將C57BL/6小鼠隨機分為CLP組、CLP+NC agomir組、CLP+miR-145-5p agomir組和假手術組(Sham組)，每組6只。CLP組、CLP+NC agomir組、CLP+miR-145-5p agomir組小鼠接受盲腸結扎穿刺(CLP)手術，建立CLP誘導的膿毒癥模型[11]，方法如下：小鼠注射10%水合氯醛(3 mL /kg，Sigma-Aldrich，St.Louis，MI，USA)，并以仰臥位固定在手術臺上，在小鼠腹部做一個4 mm的縱向切口以暴露盲腸。將暴露的盲腸在離針尖10 mm處用絲線結扎，然后在離結扎5 mm處用針穿刺1次。輕輕擠壓盲腸，擠出少量糞便后，重新定位腸管，無菌縫合腹部肌肉、腹膜和皮膚。術后立即皮下注射5 mL/100 g生理鹽水進行復蘇。Sham組進行與其他三組相同的手術過程，但不結扎或穿孔盲腸。CLP組、CLP+NC agomir組、CLP+miR-145-5p agomir組miRNA試劑、miR-145-5p agomir 和 scrambled control (NC agomir)均購置GenePharm公司(中國上海)，與線性聚乙烯亞胺(PEI)納米顆粒(Sigma-Aldrich)混合[12]。CLP手術前一周，經尾靜脈將200 μL含5 nmol miRNA (miR-145-5p agomir或NC agomir)的混懸液經靜脈注射到指定組。術后24 h對各組小鼠實施二氧化碳窒息安樂死，收集肺部組織并妥善儲存以供進一步分析。

1.3 組織學分析

采集各組同樣部位的小鼠肺組織標本用于組織病理學檢查，采用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成5 μm的切片，使用蘇木精和伊紅染色(HE)。肺損傷的程度由對實驗不知情的研究者使用肺損傷評分來估計[13]，每張切片隨機選取5個區(qū)域在400倍數下進行評分，評分越高，損傷程度越大。

1.4 細胞培養(yǎng)和轉染

分離原代小鼠肺微血管內皮細胞(primary mouse lung microvascular endothelial cells，MPVECs)置于DMEM培養(yǎng)基中，輔以10%胎牛血清(FBS；Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA，USA)、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL鏈霉素在37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)[14]。miR-145-5p模擬物(miR-145-5p mimics)和對照模擬物(NC mimics)均購自上海基因制藥有限公司(中國上海)，根據使用說明，取對數生長期的MPVECs細胞接種于6孔板中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，當細胞達60%融合時，采用Lipofectamine?2000 (Thermo Fisher Scientific，Inc.)將miR-145-5p mimics、NC mimics轉染到MPVECs細胞中。轉染24 h后，用1 mg/mL脂多糖(LPS)刺激細胞。在救援實驗中，在LPS處理24 h前，用過表達ROCK1的慢病毒載體(ROCK1)(或空慢病毒載體)和miR-145-5p模擬物共轉染MPVECs。用空慢病毒載體(vector)和對照模擬物(NC mimics)共轉染MPVECs作為對照組。

1.5 雙熒光素酶報告分析

擴增含有miR-145-5p預測結合位點的ROCK1 3’-UTR片段，并克隆到pmirGlo載體(GenePharm)中熒光素酶基因的下游。將對數生長期的MPVECs細胞接種到24孔板中(每孔1×103個細胞)，待細胞達到60%融合時，將miR-145-5p模擬物和對照模擬物分別與ROCK1 3’-UTR野生型或突變型重組質粒共轉染。轉染48 h后，使用Renilla luciferase報告基因(pRL-CMV，Promega，USA)檢測熒光素酶活性。報告基因活性采用熒光素酶檢測試劑盒(Promega，USA)根據生產廠家的方案進行測定。

1.6 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

使用miRVanaTM miRNA分離試劑盒(Invitrogen)從小鼠肺組織和MPVECs中提取靶miRNA。采用All-in-OneTM miRNA RT-qPCR Detection Kit (GeneCopoeiaInc.，Rockville，MD，USA) 對miR-145-5p進行逆轉錄。根據制造商的說明，使用ReverTra Ace qPCR RT試劑盒提取總RNA (Toyobo，Osaka，Japan)。目的基因擴增采用7300 Real-Time PCR系統(tǒng)(Applied Biosystem，Foster City，CA，USA)，U6作為miR-145-5p的內參，β-actin作為mRNA表達的內參。每個樣本檢測3次，采用2-ΔΔCt法計算表達情況。所用引物及片段大小如下：miR-145-5p (23 bp):F:5′-CCT TGT CCT CAC GGT CCA GT-3′， R:5′-AAC CAT GAC CTC AAG AAC AGT ATT T-3′； U6 (75 bp):F:5′-CGC AAG GAT GAC ACG CAA ATT CG-3′， R:5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′；IL-1β (314 bp):F:5′-CCA GGA TGA GGA CCC AAG CA-3′， R:5′-TCC CGA CCA TTG CTG TTT CC-3′； IL-6 (474 bp):F:5′-TAG CCG CCC CAC ACA GAC AG-3′，R:5′-GGC TGG CAT TTG TGG TTG GG-3′； ROCK1 (230 bp):F:5′-AAA GAA AGG ATG GAG GAT GAA GT-3′， R:5′-TGT AAC AAC AGC CGC TTA TTT G-3′； β-actin (325 bp) F:5′-ATC ACT GCC ACC CAG AAG AC-3′， F:5′-TTT CTA GAC GGC AGG TCA GG-3′。使用miRVanaTM miRNA分離試劑盒(Invitrogen)從MPVECs中提取靶miRNA，采用上述同樣的方法進行qRT-PCR實驗。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)

提取小鼠肺組織的總蛋白和MPVEC裂解液，根據制造商的說明，采用ELISA試劑盒(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA，XY-EM1810，XY-EM1624)檢測IL-6和IL-1β蛋白水平。制備MPVECs裂解液，根據制造商的說明，采用ELISA試劑盒(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA，XY-EM1810，XY-EM1624)檢測IL-6和IL-1β蛋白水平。

1.8 轉錄活性分析

小鼠肺組織中caspase-3的轉錄活性采用caspase-3檢測試劑盒(Abcam，Cambridge，UK)根據生產廠家的方案檢測。采用蛋白酶抑制劑RIPA緩沖液(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)制備肺組織勻漿。將所有樣品的蛋白濃度調整為每50 μL細胞裂解緩沖液對應100～150 μg蛋白。將50 μL羥色胺2×反應緩沖液與10 mM DTT混合，加入到50 μL的樣品中，再加入5 μL 4 mM DEVD-p-NA在37 ℃下孵育2 h。采用酶標儀在450 nm處測定過氧化物酶反應產物的光密度值。采用caspase-3檢測試劑盒(Abcam，Cambridge，UK)根據生產廠家的方案檢測MPVECs中caspase-3的轉錄活性，經LPS處理30 min后，在細胞裂解緩沖液中裂解MPVECs，采用上述同樣的方法測定過氧化物酶反應產物的光密度值。

1.9 細胞凋亡檢測

采用Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (#14085，Abcam)，根據說明書進行細胞凋亡檢測。將轉染后的MPVECs細胞培養(yǎng)于6孔板中，達到70%～80%的融合度，經LPS處理24 h后，收集細胞，離心，重懸于500 μL 1×緩沖液中，濃度為5×105個細胞/mL。然后將5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶(PI)加入樣品中，避光室溫孵育5 min。使用BD FACS流式細胞儀分析細胞凋亡率(BD Biosciences，San Jose，CA，USA)。

1.10 Western blot

采用RIA裂解緩沖液(PRO-PREPTM，iNtRON Biotechnology，Korea)提取轉染后MPVECs細胞系總蛋白。取相同量總蛋白上樣，經10% SDS-PAGE分離并轉移到PVDF膜上(MilliporeSigma，Burlington，MA，USA)，在37 ℃下用5%脫脂乳封閉1 h，加入一抗(ROCK1濃度1∶2000，#ab45171，Abcam；β-actin濃度1∶2 000，#ab32572，Abcam)在4 ℃下，持續(xù)6 h。隨后，將PVDF膜用TBS洗滌3次，每次10 min。加入羊抗兔二抗(1∶3000，#ab6721，Abcam)，室溫孵育45 h，TBS洗滌3次，每次10 min。應用AlphalmagerTM2000成像系統(tǒng)對蛋白條帶進行可視化(Alpha Innotech，San Leandro，CA，USA)，并對譜帶密度進行量化分析。

1.11 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 各組miR-145-5p表達水平及肺損傷情況比較

與Sham組相比，CLP組肺組織中miR-145-5p表達明顯降低(P<0.05)；與CLP+NC agomir組相比，在膿毒癥小鼠中注射miR-145-5p過表達質粒顯著提高了miR-145-5p的表達水平(P<0.05)(圖1A)。采用肺損傷評分法評估肺組織損傷程度，其中miR-145-5p過表達可顯著改善CLP手術引起的肺組織的損傷程度(P<0.05)(圖1B)。Sham組肺泡形態(tài)結構正常，而CLP組小鼠肺泡壁和間隔增厚，肺泡囊塌陷，可見血管充血和出血。膿毒癥小鼠注射對照agomir后的組織病理學特征與模型組相似。而miR-145-5p的誘導減輕了膿毒癥引起的肺泡損傷(圖1C)。

2.2 miR-145-5p對各組小鼠肺組織凋亡標志物的活性和炎癥因子水平的影響

與Sham組相比，CLP術后肺組織中凋亡標志物caspase-3的轉錄活性顯著升高(P<0.05)。相比CLP+NC agomir組，miR-145-5p過表達導致caspase-3的活性顯著降低(P<0.05)(圖2A)。相比Sham組，膿毒癥小鼠IL-1β和IL-6 mRNA和蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)(圖2B)。相比CLP+NC agomir組，miR-145-5p過表達可顯著降低IL-1β和IL-6的mRNA和蛋白表達水平(P<0.05)(圖2C)。

2.3 過表達miR-145-5p對脂多糖誘導的MPVECs細胞凋亡和炎癥反應的影響

采用LPS刺激MPVECs模擬體外肺損傷，與未采用LPS處理的對照組相比，經LPS處理的細胞中miR-145-5p水平顯著降低(P<0.05)。相比NC mimics組，miR-145-5p模擬物轉染顯著增加miR-145-5p的表達水平(P<0.05)(圖3A)。經LPS處理后caspase-3的活性顯著提高，而miR-145-5p過表達明顯降低了caspase-3的活性(P<0.05)(圖3B)。miR-145-5p過表達顯著抑制了LPS誘導的MPVECs中IL-1β和IL-6的mRNA和蛋白表達水平(P<0.05)(圖3C-D)。流式細胞儀數據顯示，與NC mimics組相比，LPS刺激了MPVECs的凋亡(圖3E)。提示轉染miR-145-5p模擬物可有效地降低細胞凋亡率。

2.4 miR-145-5p直接靶向ROCK1

為了探究miR-145-5p參與ALI的潛在分子機制，使用TargetScan預測miR-145-5p的下游靶點，發(fā)現ROCK1是miR-145-5p的直接靶基因，并在其3’-UTR存在一個結合位點(圖4A)。雙熒光素酶報告基因實驗顯示，轉染miR-145-5p模擬物的細胞ROCK1-WT的熒光素酶活性明顯低于NC mimics組(P<0.05)(圖4B)。此外，相比NC mimics組，miR-145-5p過表達顯著降低了ROCK1 mRNA和蛋白表達水平(P<0.05)(圖4C-D)。

2.5 miR-145-5p通過抑制ROCK1抑制細胞凋亡和炎癥反應

為進一步研究miR-145-5p是否通過靶向ROCK1調控細胞凋亡和炎癥反應，LPS處理前24 h，將miR-145-5p模擬物和過表達的ROCK1的慢病毒載體(或空載體)共轉染MPVECs。轉染后的MPVECs中ROCK1 mRNA和蛋白表達水平均顯著增加，證實了其轉染成功(圖5A-B)。與Vector+NC mimics相比，miR-145-5p+Vector共轉染MPVECs的caspase-3活性明顯降低(P<0.05)，ROCK1過表達可使caspase-3轉錄活性恢復到對照組水平(圖5C)。miR-145-5p過表達顯著抑制MPVECs中IL-1β和IL-6的mRNA和蛋白表達水平(P<0.05)，而ROCK1過表達導致IL-1β和IL-6的mRNA和蛋白表達水平顯著上調(P<0.05)(圖5D-E)。此外，過表達miR-145-5p可顯著降低MPVECs的凋亡率，而過表達ROCK1的則顯著促進MPVECs細胞凋亡(P<0.05)(圖5F)。

3 討論

膿毒癥會導致更嚴重的疾病和更高的死亡率，是造成急性肺損傷的主要病因[15-16]。ALI作為一種由過度炎癥發(fā)展而來的綜合征，具有多種潛在的治療靶點和信號傳導途徑[17]。小鼠CLP模型與人類腹部穿孔所致的膿毒癥病理生理學相似，小鼠膿毒癥模型已廣泛應用于膿毒癥所致器官功能障礙的研究中[18]。膿毒癥發(fā)生時肺部細胞凋亡的增強和促炎因子的過度表達在ALI的發(fā)病機制中起關鍵作用[19]。IL-1β和IL-6是ALI炎癥級聯(lián)反應中積極分泌的兩種促炎細胞因子[20]。抑制凋亡信號途徑和炎癥反應可能改善膿毒癥誘導的肺損caspase-3是細胞凋亡的重要標志，在ALI動物模型中已報道caspase-3轉錄活性增加[21]。本研究發(fā)現ALI小鼠模型中caspase-3活性增強，IL-1β和IL-6分泌增多，細胞凋亡率明顯增加。LPS是構成革蘭氏陰性菌外膜的內毒素，已被廣泛用于急性肺損傷的研究[22]。另外，在體外模型中，與未處理的細胞相比，LPS的刺激可導致MPVECs炎癥細胞因子水平和細胞凋亡率明顯增加，由此可見，ALI的發(fā)生發(fā)展與細胞凋亡和炎癥因子的過度激活密切相關。

研究[23]表明在LPS誘導的肺損傷小鼠模型中miRNA可能參與ALI的發(fā)生發(fā)展，其中某些類型的miRNA顯著下調，而有些miRNA顯著上調或保持不變。miRNA在ALI中作用的進一步研究表明，miRNA可通過靶向特定分子或調控下游基因來調控ALI進程中的炎癥反應和凋亡途徑[24]。Liu等[25]研究表明miR-155的下調通過靶向SIRT1抑制了CLP誘導的ALI小鼠的肺細胞凋亡和炎癥反應，提高了小鼠的存活率。miR-1246通過抑制其下游靶點ACE2降低ALI小鼠的細胞凋亡、IL-1β的釋放和中性粒細胞浸潤[26]。Xie等[27]研究表明在肺損傷過程中，miR-127表達明顯降低，而過表達miR-127通過調節(jié)巨噬細胞的CD46來減輕肺部炎癥反應。在另一項動物研究[28]發(fā)現miR-146a的上調通過抑制IRAK-1和TRAF-6的表達減輕了脂多糖誘導的ALI模型中炎癥因子的分泌。本研究發(fā)現，與假手術組相比，CLP手術后小鼠肺部組織miR-145-5p水平顯著下調。而術前轉染miR-145-5p模擬物可有效緩解膿毒癥誘導的肺損傷，同時可有效降低caspase-3的轉錄活性，抑制炎癥細胞因子IL-1β和IL-6的表達，降低細胞凋亡率。此外，miR-145-5p在脂多糖處理的MPVECs中也表現出同樣的抗凋亡和抗炎的作用。此外，ROCK1被預測并證實為miR-145-5p的直接下游靶點。前期CLP大鼠模型研究[29]表明，ROCK1的激活參與了膿毒癥誘導ALI的發(fā)病機制，可能與氧化應激和凋亡有關。在本研究中，ROCK1過表達可使caspase-3轉錄活性恢復到對照組水平，而ROCK1過表達導致IL-1β和IL-6的mRNA和蛋白表達水平顯著上調。此外，過表達ROCK1則顯著促進MPVECs細胞凋亡。提示miR-145-5p通過抑制其下游目標ROCK1的表達，改善膿毒癥誘導的急性肺損傷。本研究通過探討miR-145-5p在體內外對膿毒癥誘導的ALI發(fā)生的分子機制，發(fā)現miR-145-5p在膿毒癥模型中誘導降低促炎細胞因子IL-1β和IL-6的表達，抑制凋亡標志物caspase-3的轉錄活性。進一步研究發(fā)現，miR-145-5p通過負調控其下游靶點ROCK1的表達，降低膿毒癥誘導的ALI細胞凋亡和炎癥反應。

綜上所述，miR-145-5p通過下調ROCK1的表達，減輕了膿毒癥誘導的ALI肺部細胞凋亡和促炎細胞因子的產生。miR-145-5p有望作為膿毒癥誘導的ALI治療的潛在靶點。