鄧 侃，陳廷濤，彭穎征

靶向重組Aif-T18融合蛋白對TEM1陽性腫瘤細(xì)胞的殺傷作用的研究

鄧 侃1，陳廷濤2，*彭穎征3

（1.吉安職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江西，吉安 343000；2.南昌大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，江西，南昌 330031；3.廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，福建，廈門 361003）

驗證Aif-T18融合蛋白對腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志分子1（TEM1）陽性腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。采用基因工程技術(shù)方法構(gòu)建重組質(zhì)粒pIRES-TEM1-EGFP，轉(zhuǎn)染TEM1陰性表達(dá)細(xì)胞MS1，經(jīng)G418篩選得到TEM1陽性細(xì)胞株（MS1-TEM1）；通過構(gòu)建重組質(zhì)粒pET302-Aif和pET302-Aif-T18，轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌中，經(jīng)異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)菌體得到所需的目的蛋白，采用流式細(xì)胞儀和MTT技術(shù)檢測融合蛋白對MS1和MS1-TEM1細(xì)胞的親和力和特異性殺傷的效果。本研究中，主要利用單鏈抗體scFvT18選擇性攜帶凋亡誘導(dǎo)因子AIF，靶向抑殺TEM1陽性細(xì)胞，從而為Aif-T18融合蛋白在腫瘤治療中的開發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗依據(jù)。

TEM1；單鏈抗體；Aif

近年來，惡性腫瘤的發(fā)病率逐漸增高，嚴(yán)重威脅著人們的生命安全和健康[1]。由于腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性和遺傳不穩(wěn)定性等特點(diǎn)[2]，對于腫瘤的治療難以達(dá)到預(yù)期的效果[3-4]。此外，腫瘤微環(huán)境包括腫瘤新生血管、血管周細(xì)胞、基質(zhì)和間質(zhì)細(xì)胞等為腫瘤細(xì)胞提供了生存和生長所需的營養(yǎng)及浸潤途徑，它能使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的識別和抗原提呈，從而增加了機(jī)體殺傷腫瘤的難度。然而，與腫瘤細(xì)胞相比，這些構(gòu)成腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞具有遺傳性質(zhì)穩(wěn)定和較低的突變率，又不同于其他正常組織細(xì)胞，它們是理想的腫瘤靶向目標(biāo)。

最新的研究表明，TEM1可以在幾乎所有實(shí)體瘤相關(guān)細(xì)胞中大量表達(dá)[5-6]，但在正常細(xì)胞中不表達(dá)或者表達(dá)水平極低[7-8]，它是一種理想的腫瘤靶向基因[9-10]。因此，本研究擬使用在前期研究中經(jīng)酵母抗體庫篩選分離獲得可以同時結(jié)合人類與鼠類TEM1的高親和力、特異性單鏈抗體（scFvT18），并攜帶全人源化生物毒素（如人源化毒素AIF），最終通過靶向殺傷TEM1陽性細(xì)胞達(dá)到抑殺腫瘤細(xì)胞的效果[11]。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗材料

pMCV6-XL4載體、pGEM-3ZF（-）載體、pIRES-EGFP載體、pET302載體、MS1細(xì)胞株等由本實(shí)驗室保存；重組質(zhì)粒pET302-Aif-T18與pET302-Aif在南昌大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗室完成構(gòu)建和實(shí)驗。

1.2 試劑

T4 DNA連接酶、10 kb plus DNA ladder購自日本TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶和購自美國NEB公司。Gel Extraction Kit、Plasmid Mini Kit I購自美國OMEGA公司；胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司；G418購自美國Invitrogen公司；一抗（兔His-Tag抗體）、二抗（鼠抗兔抗體）、臺盼藍(lán)、氨芐霉素（Amp）購自美國Sigma公司。

1.3 實(shí)驗儀器

CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；倒置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；Biofuge Stratos臺式高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo公司）；LEGEND Micro21R微量臺式離心機(jī)（美國Thermo公司）；PCR儀（美國Bio-Rad公司）；SW-CJ-2FD型超凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；流式細(xì)胞儀（德國MerckMillipore公司）；DYY-2C瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)（北京六一儀器廠）；WD-9403C型紫外分析儀（北京市六一儀器廠）。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 TEM1陽性腫瘤細(xì)胞系構(gòu)建

pCMV6-XL4和pGEM? -3Zf(-)分別用1 μL與1 μL雙酶切，50 μL總體系。酶切產(chǎn)物回收后電泳，將目的DNA進(jìn)行回，酶連得到重組質(zhì)粒pGEM? -3Zf(-)-TEM1，將其轉(zhuǎn)化至top10后質(zhì)粒提取，用、酶切pGEM? -3Zf(-)-TEM1與pIRES-EGFP，成功地構(gòu)建了pIRES-TEM1-EGFP重組質(zhì)粒。

從液氮迅速取出MS1細(xì)胞，置于37℃水浴，快速搖動，電轉(zhuǎn)pIRES-TEM1-EGFP至MS1細(xì)胞，電壓設(shè)置為1.8 KV，細(xì)胞在G418（100 mg/mL)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用熒光顯微鏡觀察其熒光表達(dá)，將這些細(xì)胞消化，以每孔100 μL加至96孔板生長，每3~4 d更換含G418培養(yǎng)基，密切關(guān)注細(xì)胞生長情況。當(dāng)視野下70%~80%占據(jù)熒光細(xì)胞時，將其更換至24孔板進(jìn)一步培養(yǎng)。用10% DMSO胎牛血清的將細(xì)胞低溫保存于液氮罐。

1.2.2 Aif-T18融合蛋白的表達(dá)及純化

IPTG誘導(dǎo)pET302-Aif-T18和pET302-Aif單克隆菌體獲得包涵體，洗滌后，加至8M尿素溶解，終濃度30~50 mg/mL，室溫下旋轉(zhuǎn)4 h，13000 rpm 離心30 min，緩慢加入2M尿素，混勻，置于4℃條件下復(fù)性36~48 h后，離心，轉(zhuǎn)速8000 rpm，與His beads按1:4混合，置于4℃旋轉(zhuǎn)儀，4 h后，加入500 mM的咪唑洗脫蛋白，洗脫蛋白經(jīng)PBS透析，Western Blot鑒定，一抗用封閉液按1:1000的比例稀釋后在4℃搖床中緩慢搖動過夜進(jìn)行回收。加TBS-T洗滌液，重復(fù)3次，時間15 min。二抗與封閉液按1:2500濃度稀釋加入TBS-T洗滌液，重復(fù)3次，時間15 min。置于凝膠成像儀，顯色。

1.2.3 重組Aif-T18融合蛋白對TEM1陽性腫瘤細(xì)胞的結(jié)合

吸出細(xì)胞上清，細(xì)胞用DHanks溶液沖洗，重復(fù)兩遍，吸盡DHanks，加5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱，吸出培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，加10 mL versene溶液，放置約10~30 min，直至細(xì)胞變圓，用吸管吹打從而分離細(xì)胞，添加9 mL培養(yǎng)基（10%FBS）和等分試樣的細(xì)胞成14管（1 mL/管）標(biāo)記MS1 14管和MS1-TEM1 14管，離心，1200 rpm，4 ℃，5 min，將上清緩慢小心地吸出，加入100 uL培養(yǎng)基（10％FBS），冰上孵育30 min，洗滌3次，100 μL培養(yǎng)基重懸，添加抗His-Ab -APC，在冰上孵育30 min，如前面方法洗滌3次，300 μL FACS緩沖液懸浮細(xì)胞用，轉(zhuǎn)移細(xì)胞進(jìn)入FACS管用于FACS分析。

1.2.4 重組Aif-T18融合蛋白對TEM1陽性腫瘤細(xì)胞的殺傷效果

在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，若細(xì)胞處于對數(shù)期，則進(jìn)行細(xì)胞消化，以5×104/mL濃度接種于4塊96孔板，（MS1細(xì)胞和MS1-TEM1細(xì)胞各兩塊），每孔200 μL。于5% CO2、37℃培養(yǎng)，每天間隔3~6 h光鏡下觀察加藥（1μM）后MS1細(xì)胞和MS1-TEM1細(xì)胞細(xì)胞的凋亡情況，待發(fā)現(xiàn)有明顯細(xì)胞皺縮甚至細(xì)胞小碎片出現(xiàn)后，終止培養(yǎng)，利用MTT法評價其細(xì)胞活性。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( mean±SD) 表示，用 SPSS 13．0 軟件分析，采用 Student-t 檢驗分析不同實(shí)驗組間差異，＜0.05 表示有統(tǒng)計學(xué)差異，＜0.01 表示統(tǒng)計學(xué)顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 TEM1陽性腫瘤細(xì)胞系構(gòu)建

2.1.1 pCMV6-XL4與pGEM? -3Zf(-)酶切鑒定

從商品化的、包含TEM1全長序列的pCMV6-XL4（購自O(shè)RIGENE公司）利用和雙酶切得到大約2600 bp的TEM1序列（條帶1），并將其裝入到同樣經(jīng)和雙酶切的pGEM? -3Zf(-)質(zhì)粒。

M：DL10000，1：酶切后的pCMV6-XL4，2：酶切后的pGEM? -3Zf(-)

2.1.2 pGEM-3ZF-TEM1與PIRES-EGFP酶切結(jié)果

重組質(zhì)粒pGEM? -3Zf(-)-TEM1與質(zhì)粒pIRES-EGFP分別經(jīng)與酶切，電泳后分別獲得5200 bp（泳道1）和2600 bp（泳道2）左右的目的條帶(圖2)，測得濃度分別是38.9、42.1 ng/μL。

M：DL10000，1：酶切pGEM? -3Zf(-)-TEM1，2：酶切pIRES-EGFP

2.1.3 MS1-TEM1穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建

重組質(zhì)粒pIRES-TEM1-EGFP電轉(zhuǎn)入MS1細(xì)胞。培養(yǎng)24 h，熒光顯微鏡下100倍與200倍視野觀察具有熒光表達(dá)，細(xì)胞在白光下生長良好，表明轉(zhuǎn)染成功，利用G418篩選獲得MS1-TEM1穩(wěn)定細(xì)胞系。

圖3 熒光顯微鏡TEM1陽性細(xì)胞轉(zhuǎn)染及驗證

2.1.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MS1與MS1-TEM1細(xì)胞驗證

將重組質(zhì)粒pIRES-TEMI-EGFP分別轉(zhuǎn)染MS1與MS1-TEM1，Western Blot驗證TEM1陽性細(xì)胞具有目的蛋白TEM1表達(dá)，表明成功構(gòu)建了MS1-TEM1細(xì)胞系（圖4）。

1：MS1陰性對照 2：MS1-TEM1

2.2 Aif-T18融合蛋白以及Aif蛋白表達(dá)與純化

將重組質(zhì)粒pET302-Aif-T18以及pET302-Aif轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，過夜活化，次日加入200 mL LB培養(yǎng)液，37℃，加IPTG誘導(dǎo)4 h，超聲破碎獲得包涵體，經(jīng)變性、復(fù)性得到可溶性活性蛋白。如圖6A和6B所示，pET302-Aif約為70 kDa，pET302-Aif-T18約為100 kDa。而后純化蛋白。獲得純度95%的Aif-T18（條帶3）與Aif（條帶1）如圖5A所示，Western-Blot結(jié)果證實(shí)為目的蛋白如圖5B所示。

圖A ：M：Marker，1：純化Aif， 2：未純化Aif，3：純化Aif-T18，4：未純化Aif-T18。圖B：Western Blot。一抗：His抗體二抗：羊抗鼠-HRP

2.3 Aif-T18融合蛋白以及Aif蛋白對細(xì)胞的結(jié)合

將Aif-T18與MS1、MS1-TEM1細(xì)胞共同培養(yǎng)，通過流式細(xì)胞儀檢測目的蛋白與MS1-TEM1的結(jié)合能力。圖6A表明Aif-T18與Aif對TEM1對MS1細(xì)胞沒有結(jié)合能力；圖6B標(biāo)明Aif對MS1-TEM1細(xì)胞沒有結(jié)合能力，但融合蛋白Aif-T18能較強(qiáng)的與MS1-TEM1結(jié)合，說明融合蛋白Aif-T18與MS1-TEM1細(xì)胞具有良好的特異性以及較強(qiáng)的結(jié)合能力。

圖A：Aif-T18，Aif對MS1的結(jié)合能力，圖B：Aif-T18，Aif對MS1-TEM1的結(jié)合能力

2.4 重組Aif-T18融合蛋白對TEM1陽性腫瘤細(xì)胞的殺傷效果

為進(jìn)一步驗證Aif-T18以及Aif對MS1與MS1-TEM1的殺傷能力。圖7 A和圖7 B顯示，培養(yǎng)24 h，1 μM的Aif-T18和Aif對MS1與MS1- TEM1基本沒有殺傷作用；此后，每天間隔3~6 h在光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)顯著皺縮甚至小碎片，終止培養(yǎng)，MTT評價細(xì)胞活性。如圖7 C和7 D，72 h，Aif-T18與Aif都可明顯殺傷MS1（<0.01）與MS1-TEM1。在MS1組，Aif-T18和Aif殺傷效果沒有明顯差別，而在MS1-TEM1組，Aif-T18對細(xì)胞殺傷作用明顯高于Aif，表示AIF在體外殺傷效果明顯，但融合蛋白的靶向作用效果顯著高于AIF的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)率。

圖A和B：24 h后Aif，Aif-T18對MS1與MS1-TEM1細(xì)胞的殺傷作用，圖C和D：72 h后Aif，Aif-T18對MS1與MS1-TEM1細(xì)胞的殺傷作用（**：P < 0.01）

3 討論

TEM1是一種細(xì)胞膜蛋白，主要在腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞以及部分腫瘤細(xì)胞中表達(dá)[12]，因此可用于腫瘤靶向治療。利用酵母菌展示技術(shù)，從人外周血細(xì)胞分離到單鏈抗體T18，且證明其能與TEM1蛋白高度結(jié)合[13-14]。因而利用T18攜帶的治療性物人源化毒素AIF，可特異性地靶向遺傳性狀穩(wěn)定的腫瘤細(xì)胞微環(huán)境。

TEM1用于腫瘤治療的靶點(diǎn)具有重要意義。（1）TEM1主要與細(xì)胞外基質(zhì)中的纖維連接蛋白、Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原相互作用，加速外周細(xì)胞的增殖，使其分泌能夠降解血管外基質(zhì)蛋白酶，有助于內(nèi)皮細(xì)胞的遷移[15]。（2）在正常組織中血管生成基本不出現(xiàn)，因而靶向血管生成只針對腫瘤組織細(xì)胞，不會對正常組織細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重副作用[16]。（3）臨床已經(jīng)證明腫瘤的抗血管生成治療具有良好的療效和廣譜的抗腫瘤作用[17]。

本研究中將人源化毒素（AIF）與單鏈抗體T18融合表達(dá)，結(jié)果表明重組蛋白AIF-T18能與TEM1陽性細(xì)胞系（MS1-TEM1）特異性地結(jié)合并對該細(xì)具有顯著殺傷作用。此外，由于TEM1在實(shí)體瘤細(xì)胞中有特異性表達(dá)[18-19]，因此，T18和毒素AIF的構(gòu)建可以發(fā)揮更為特異的抗腫瘤作用，為腫瘤的治療提供新的方向和思路。下一步將驗證融合蛋白在人體內(nèi)的作用效果。

[1] 楊潮,何小楊,莫淑芳,等．人WDR79基因啟動子表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定[J]. 井岡山大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2019,40(3):31-34+55.

[2] 劉志強(qiáng),王博龍．基于TCMSP抗腫瘤中藥小分子EGFR-TKI的研究[J].井岡山大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版, 2018,39(2):87-92.

[3] Yang H, Fang L, Zhan R, et al. Polo-like kinase 2 regulates angiogenic sprouting and blood vessel development [J]. Dev Biol, 2015, 404(2): 49-60.

[4] Ferrara N, Kerbel R S. Angiogenesis as a therapeutic target [J]. Nature, 2005, 438(7070): 967-74.

[5] Pietrzyk L. Biomarkers discovery for colorectal cancer: a review on tumor endothelialmarkers as perspective candidates[J]. Disease markers, 2016, 2016.

[6] Rak J, Al-Nedawi K, Meehan B, et al. Tumor cell-derived microvesicles: U.S.Patent 9,186,405[P]. 2015-11-17.

[7] Opavsky R, Haviernik P, Jurkovicova D, et al. Molecular Characterization of theMouseTem1/endosialin Gene Regulated by Cell Density in Vitro and Expressed in NormalTissues in Vivo[J]. Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(42): 38795-38807.

[8] Teicher B A. CD248: A therapeutic target in cancer and fibrotic diseases[J]. Oncotarget, 2019,10(9): 993.

[9] O'leary A P, Fox J M, Pullar C E. Beta-Adrenoceptor Activation Reduces Both Dermal Microvascular Endothelial Cell Migration via a cAMP-Dependent Mechanism and Wound Angiogenesis [J]. J Cell Physiol, 2015, 230(2): 356-65.

[10] Fagiani E, Loentz P, Bill R, et al. VEGF receptor-2- specific signaling mediated by VEGF-E induces hemangioma-like lesions in normal and in malignant tissue [J]. Angiogenesis, 2016(35):1-20.

[11] 鄧侃. Aif-T18融合蛋白對TEM1陽性細(xì)胞的體外殺傷效果評價[D].南昌:南昌大學(xué),2016.

[12] Santoro S. T cells bearing a chimeric antigen receptor against the tumor vasculature destroy the tumor endothelium and result in tumor regression [J]. J cell physiol,2014,

[13] Yuan X, Chen X, Yang M, et al. Efficient construct of a large and functional scFv yeast display library derived from the ascites B cells of ovarian cancer patients by three-fragment transformation-associated recombina- tion[J]. Applied microbiology and biotechnology, 2016, 100(9): 4051-4061.

[14] Yuan X, Yang M, Chen X, et al. Characterization of the first fully human anti-TEM1 scFv in models of solid tumor imaging and immunotoxin-based therapy[J]. Cancer immunology, immunotherapy, 2017, 66(3): 367-378.

[15] Hong Y K, Lee Y C, Cheng T L, et al. Tumor Endothelial Marker 1 (TEM) Enhances Wound Healing by Interacting with Platelet-Derived Growth Factor Receptors[J]. Journal of Investigative Dermatology,2019, 139(10): 2204-2214.

[16] Shen J, Xiao Z, Zhao Q, et al. Anti‐cancer therapy with TNF α and IFN γ: Acomprehensive review[J]. Cell proliferation, 2018, 51(4): e12441.

[17] Abdalla A M E, Xiao L, Ullah M W, et al. Current challenges of cancer anti-angiogenic therapy and the promise of nanotherapeutics[J]. Theranostics, 2018, 8(2): 533.

[18] Yuan X, Yang M, Chen X, et al. Correction to: Characterization of the first fully human anti-TEM1scFv in models of solid tumor imaging and immunotoxin- based therapy[J]. Cancer Immunology, Immunotherapy, 2018, 67(2): 329-339.

[19] Wang Z, Tang Y, Tan Y, et al. Cancer-associated fibroblasts in radiotherapy: challenges and new opportunities[J]. Cell Communication and Signaling, 2019, 17(1): 47.

EVALUATION OF KILLING EFFECT OF AIF-T18 FUSION PROTEIN ON TEM1 POSITIVE CANCER CELLS

DENG Kan1, CHEN Ting-tao2,*PENG Ying-zheng3

(1. Vocational College of Ji’an, Ji’an, Jiangxi 343000, China; 2. Institute of Translational Medicine, Nanchang University, Nanchang, Jiangxi 330031, China; 3. Department of Pathology, The First Affiliated Hospital of Xiamen University, Xiamen, Fujian 361003, China）

To verify the killing effect of Aif-T18 fusion protein on tumor endothelial cell marker molecule 1 (TEM1) positive tumor cells, genetic engineering technology was used to construct the recombinant plasmid pIRES-TEM1-EGFP, transfected with TEM1-negative expression cell MS1, and screened by G418 to obtain TEM1-positive cell lines (MS1-TEM1). The recombinant plasmids pET302-Aif and pET302-Aif-T18, transformed into the expression host strain BL21, and the target protein was induced by bacterial cells induced by isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG). The affinity and specific killing effect of the fusion protein on MS1 and MS1-TEM1 cells were detected by flow cytometry and MTT. In this study, the single-chain antibody scFvT18 was used to carry the apoptosis-inducing factor AIF selectively and target and suppress TEM1-positive cells, thereby providing an experimental basis for the development and application of Aif-T18 fusion protein in tumor therapy.

TEM1; single chain antibody; Aif

R73-3

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2021.01.008

1674-8085(2021)01-0043-06

2020-10-22；

2020-12-02

國家自然科學(xué)基金項目( 31360377)；江西省教育廳青年科學(xué)基金項目（GJJ14197，GJJ14218）

鄧 侃(1990-)，男，江西吉安人，助教，碩士，主要從事單克隆抗體研究(E-mail: dengkan199006@ 126.com);

陳廷濤(1984-)，男，江西南昌人，副教授，博士，主要從事微生物研究(E-mail:695237096@qq.com);

*彭穎征(1989-)，男，江西樟樹人，技師，主要從事分子病理研究(E-mail:1067716910@qq.com).