林瑞環(huán) 趙 玲 曹 榮,3 劉 淇

南極磷蝦與鷹爪糙對(duì)蝦酚氧化酶生化性質(zhì)對(duì)比分析*

林瑞環(huán)1,2趙 玲2曹 榮2,3①劉 淇2

(1. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海 200090；2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071； 3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋藥物與生物制品功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071)

黑變是南極磷蝦()貯運(yùn)流通過程中的突出問題，為探究南極磷蝦與普通海捕蝦在黑變進(jìn)程方面的異同，選取南極磷蝦和海捕鷹爪糙對(duì)蝦()作為研究對(duì)象，對(duì)2種蝦在(2±1)℃貯藏過程中的黑變進(jìn)程進(jìn)行了感官評(píng)價(jià)，提取其酚氧化酶(PO)并進(jìn)行了純化，對(duì)2種蝦PO的生化性質(zhì)進(jìn)行了對(duì)比分析。結(jié)果顯示，冷藏條件下，24 h時(shí)南極磷蝦的黑變已非常嚴(yán)重，黑變部位主要集中在頭胸部、腹部甲殼以及尾節(jié)部分。72 h時(shí)鷹爪糙對(duì)蝦的頭胸部和尾節(jié)部分開始有輕微的黑變，之后逐漸擴(kuò)散到軀干。南極磷蝦和鷹爪糙對(duì)蝦PO粗酶液經(jīng)硫酸銨沉淀、Sephadex G-100凝膠過濾后，酶的純化倍數(shù)分別達(dá)到17.22和19.67。2種蝦PO的最適溫度分別為30℃和40℃，南極磷蝦PO在低溫下仍具有較高的活力。二者的最適pH均為6.0~7.0之間。焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、4-己基間苯二酚、L-半胱氨酸和抗壞血酸均可較好地抑制2種蝦PO活力，其中，4-己基間苯二酚抑制效果最好。研究結(jié)果為南極磷蝦冷鏈物流過程中的品質(zhì)控制提供了依據(jù)，同時(shí)，為蝦死后如何有效抑制其黑變提供了參考。

黑變；南極磷蝦；鷹爪糙對(duì)蝦；酚氧化酶

蝦在我國(guó)漁業(yè)經(jīng)濟(jì)中占有重要地位，鮮銷是其主要的產(chǎn)品形態(tài)，然而，鮮蝦在流通和儲(chǔ)藏過程中有一最為突出的問題––黑變。蝦的黑變是其體內(nèi)的酪氨酸或其衍生物等色原物質(zhì)在酶的作用下經(jīng)過一系列生化反應(yīng)最終形成黑色素的過程，這一過程與酚氧化酶(Phenoloxidase, PO)密切相關(guān)(Bego?a, 2010)。PO可以催化蝦體中的無色單酚化合物向雙酚及雙酚化合物轉(zhuǎn)化，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)進(jìn)一步與氨基酸或蛋白質(zhì)結(jié)合生成黑色素，產(chǎn)生黑變，從而嚴(yán)重影響蝦的外觀，制約其商業(yè)價(jià)值(Friedman, 1996)。

PO是蝦類黑色素生成反應(yīng)的限速酶，研究其生化性質(zhì)對(duì)于探究蝦的黑變機(jī)理及防控方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前，已有國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦() (Rolle, 1991)、桃紅對(duì)蝦() (Simpson, 1998)、中國(guó)對(duì)蝦() (汪小鋒等, 2003)、日本對(duì)蝦() (Soottawat, 2005)、長(zhǎng)額擬對(duì)蝦() (José-Pablo, 2009)和凡納濱對(duì)蝦() (鮑俊旺等, 2019)等的PO進(jìn)行了分離純化和生化性質(zhì)研究，發(fā)現(xiàn)不同種類蝦的PO在分子量、等電點(diǎn)、最適pH值、熱穩(wěn)定性以及動(dòng)力學(xué)參數(shù)等方面均有很大差異。對(duì)于蝦黑變的控制目前主要采用化學(xué)法，如亞硫酸鹽類(李小蕾等，2012)、4-己基間苯二酚(周宇芳等, 2019)以及一些天然提取物(Jang, 2003; Nilesh, 2009; Nalan, 2008)等，均表現(xiàn)出了很好的防黑變效果，但對(duì)于酚酶活性的影響研究尚不夠全面。

南極磷蝦()富含8種人體必需氨基酸且比例適宜，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值(聶玉晨等, 2016; 曹榮等, 2018b)，廣泛分布于環(huán)南極大陸架水域，資源量極為豐富。在世界近海漁業(yè)資源普遍衰退的情況下，南極磷蝦已成為世界漁業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家競(jìng)相開發(fā)利用的海洋新資源(曹榮等, 2018a)。在其運(yùn)輸過程中，大部分采用船上冷凍保藏到陸地上解凍二次加工的方法，在此過程中很容易發(fā)生自溶、黑變等變化，影響南極磷蝦品質(zhì)(陳怡炫等, 2018)。我國(guó)從2009年開始對(duì)南極磷蝦進(jìn)行大規(guī)模的商業(yè)化捕撈和加工(黃洪亮等, 2015)，但在船載加工技術(shù)和設(shè)備方面還比較落后，在南極磷蝦貯運(yùn)與利用方面的研究也比較薄弱(諶志新等, 2019)。鷹爪糙對(duì)蝦()又稱立蝦、紅蝦，體型較小，體長(zhǎng)與南極磷蝦相似，是我國(guó)黃、渤海產(chǎn)量較高的一種海捕蝦類，味道鮮美，是加工“金鉤海米”的原材料(張樹德等，1992)。目前，已有較多關(guān)于大宗蝦類品種黑變方面的研究報(bào)道，但對(duì)南極磷蝦黑變以及PO性質(zhì)的相關(guān)研究較少，南極磷蝦與普通海捕蝦在黑變進(jìn)程和機(jī)制方面是否存在差異也尚未可知。

本文選取南極磷蝦及鮮活鷹爪糙對(duì)蝦作為研究對(duì)象，觀察2種蝦在(2±1)℃貯藏過程中的黑變進(jìn)程，從頭胸部提取到PO粗酶并進(jìn)行了純化，對(duì)2種蝦PO的生化性質(zhì)進(jìn)行了對(duì)比分析，旨在為南極磷蝦冷鏈物流過程中的品質(zhì)控制和死后黑變機(jī)理研究等提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原料與試劑

南極磷蝦由遼寧省大連海洋漁業(yè)集團(tuán)南極磷蝦作業(yè)船于2018年11月在南極海域捕撈，捕后包被冰衣，–30℃凍藏，2019年5月運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室后，迅速用流動(dòng)水解凍，選取完整的南極磷蝦進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

鮮活鷹爪糙對(duì)蝦購(gòu)于青島市埠東水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)，充氧條件下30 min內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，剔除死亡個(gè)體，選取體長(zhǎng)均一個(gè)體(4~5 cm)，流水沖洗后加冰猝死，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

L-3,4-二羥基苯丙氨酸、硫酸銨、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、植酸鈉、L-半胱氨酸、4-己基間苯二酚(4-HR)、抗壞血酸、苯甲酸、檸檬酸和乳酸等均為分析純，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑變進(jìn)程觀察 將解凍后的南極磷蝦與猝死后的鷹爪糙對(duì)蝦分別放置于(2±1)℃冰箱中，定期取樣觀察其黑變情況。

1.2.2 PO粗酶液的制備與部分純化 參照汪小鋒等(2003)的方法，略有改動(dòng)。取蝦的頭胸部按1∶5 (/)比例加入預(yù)先冷卻的磷酸鹽緩沖溶液(0.1 mol/L, pH 7.2)，剪碎、均質(zhì)30 min后離心(4℃, 8000 r/min, 20 min)，取上清液，測(cè)定蛋白質(zhì)含量及酶活力。

在上清液中緩慢加入固體硫酸銨粉末，并不斷攪拌，分別收集0~40%、40%~75%和75%~100%部分的沉淀。將3組沉淀分散于磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.2)中，透析24 h，離心(4℃, 8000 r/min, 20 min)后取上清液，分別測(cè)定蛋白質(zhì)含量及酶活力。

Sephadex G-100凝膠過濾柱(1.8 cm×75.0 cm)經(jīng)磷酸緩沖液(0.1 mol/L, pH 7.2)預(yù)平衡后，取40%~75%硫酸銨沉淀對(duì)應(yīng)的組分上柱，以0.5 ml/min的流速進(jìn)行洗脫，檢測(cè)280 nm下的吸光度值，收集蛋白峰對(duì)應(yīng)的組分，檢測(cè)酶活力，收集酶活較高的管數(shù)，超濾濃縮后–80℃保存，留待后續(xù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定。

1.2.3 PO比活力測(cè)定 參照Zamorano等(2009)的方法，略有改動(dòng)。以L-3,4-二羥基苯丙氨酸為底物，將2.0 ml磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.2)與2.0 ml L-3,4-二羥基苯丙氨酸溶液(20.0 mmol/L)混合，30℃水浴中孵育，加入待測(cè)酶液0.2 ml混勻，反應(yīng)5 min后，在波長(zhǎng)為475 nm處測(cè)定吸光度值。每分鐘吸光度值增加0.001定義為1個(gè)酶活力單位(U)。

采用雙縮脲法測(cè)蛋白質(zhì)含量，計(jì)算比活力(U/mg)。

1.2.4 溫度對(duì)酚氧化酶活力的影響 將底物與待測(cè)酶液分別在5℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃和60℃條件下孵育后混合，反應(yīng)5 min后測(cè)定酶活力。

1.2.5 pH對(duì)酚PO活力的影響 將底物與不同pH的緩沖溶液混合，使反應(yīng)體系的最終pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，30℃水浴中孵育，加入待測(cè)酶液0.2 ml混勻，反應(yīng)5 min后測(cè)定酶活力。

1.2.6 化學(xué)試劑對(duì)PO活力的影響 分別配制0.1%(/)的焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、植酸鈉、L-半胱氨酸、4-己基間苯二酚、抗壞血酸、苯甲酸、檸檬酸和乳酸水溶液。將底物溶液與上述溶液1∶1(/)混合，30℃水浴中孵育，加入待測(cè)酶液0.2 ml混勻，反應(yīng)5 min后，在波長(zhǎng)為475 nm處測(cè)定吸光度值，計(jì)算酶活力。以磷酸鹽緩沖溶液為對(duì)照，計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，<0.01為極顯著，<0.05為顯著，>0.05為不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 南極磷蝦與鷹爪糙對(duì)蝦冷藏過程黑變進(jìn)程

由表1可以看出，南極磷蝦的黑變進(jìn)程與鷹爪糙對(duì)蝦相比更為迅速。冷藏條件下24 h時(shí)，南極磷蝦的黑變已經(jīng)非常明顯，黑變部位集中在頭胸部、腹部甲殼以及尾節(jié)部分，這與長(zhǎng)額擬對(duì)蝦(José-Pablo, 2009)發(fā)生黑變的規(guī)律類似。鷹爪糙對(duì)蝦在72 h時(shí)可以觀察到頭胸部、尾節(jié)部分有輕微的黑變，之后逐漸擴(kuò)散到軀干。鷹爪糙對(duì)蝦不同個(gè)體間的黑變進(jìn)程略有差別，這可能與其死前的生理狀態(tài)有關(guān)，蝦個(gè)體在底物水平、酶激活因子等方面的差異也會(huì)影響黑變的進(jìn)程。

2.2 南極磷蝦與鷹爪糙對(duì)蝦PO分離純化結(jié)果

對(duì)2種蝦PO的純化結(jié)果見表2。南極磷蝦PO粗酶液的比活力為1.58 U/mg，經(jīng)硫酸銨沉淀后，得到初步純化酶，其中，40%~75%硫酸銨沉淀組分的蛋白回收率為40.67%，酶活回收率高達(dá)67.11%，比活力提高至2.61 U/mg，該組分經(jīng)Sephadex G-100凝膠過濾后，比活力達(dá)27.25 U/mg，純化倍數(shù)提高至17.22。

鷹爪糙對(duì)蝦PO粗酶液的比活力為1.28 U/mg，略低于南極磷蝦，且PO活性主要集中在0~40%硫酸銨沉淀部分，酶活回收率達(dá)59.55%，這與趙嬌等(1997)發(fā)現(xiàn)日本對(duì)蝦PO活性主要存在于0~40%硫酸銨沉淀組分中一致。該組分經(jīng)Sephadex G-100凝膠過濾后，比活力提高至25.21 U/mg，酶的純化倍數(shù)達(dá)到19.67。

2.3 溫度對(duì)PO活力的影響

溫度對(duì)2種蝦PO活力的影響如圖1。南極磷蝦PO在5℃和10℃條件下，活力極顯著高于鷹爪糙對(duì)蝦(<0.01)，這與其在低溫儲(chǔ)藏時(shí)黑變發(fā)生更為迅速的現(xiàn)象一致，最適溫度在30℃左右，50℃以上活力迅速下降，這可能與南極磷蝦生長(zhǎng)的環(huán)境溫度較低，南極海域海水溫度范圍在–1.3℃~3.0℃(李瑩春等, 2012)有關(guān)。

鷹爪糙對(duì)蝦PO在低溫條件下活力較低，而50℃和60℃下的活力顯著高于南極磷蝦。鷹爪糙對(duì)蝦PO的最適溫度在40℃左右，這與凡納濱對(duì)蝦(鮑俊旺等, 2019; Nilesh, 2011)、中國(guó)對(duì)蝦(樊廷俊等, 2002)等PO的最適溫度接近。

圖1 溫度對(duì)南極磷蝦與鷹爪糙對(duì)蝦PO活力影響

*表示差異顯著(<0.05)；**表示差異極顯著(<0.01)

*: The difference is significant (<0.05);**: The difference is highly significant (<0.01)

2.4 pH對(duì)PO活力的影響

南極磷蝦和鷹爪糙對(duì)蝦PO隨pH的變化規(guī)律較為一致，如圖2所示，最適pH均在6.0~7.0范圍內(nèi)，酸性或堿性條件對(duì)酶活力都有一定的抑制作用，因此，南極磷蝦在運(yùn)輸過程中提供一個(gè)酸性冷凍環(huán)境對(duì)其保鮮期延長(zhǎng)效果會(huì)有幫助。

圖2 pH對(duì)南極磷蝦與鷹爪糙對(duì)蝦PO活力影響

2.5 化學(xué)試劑對(duì)PO活力的影響

化學(xué)法是抑制蝦類黑變最為常見的方法。幾種化學(xué)試劑對(duì)2種蝦PO活力的影響見圖3。植酸鈉、苯甲酸、檸檬酸和乳酸未表現(xiàn)出明顯的PO抑制效果。焦亞硫酸鈉和亞硫酸氫鈉對(duì)南極磷蝦和鷹爪糙對(duì)蝦PO均有較好的抑制作用，相對(duì)酶活都低于60%。亞硫酸鹽類在控制蝦類黑變中應(yīng)用廣泛(李小蕾等, 2012; Ferrer, 1989)，其分解后釋放的SO2可有效抑制PO活性，同時(shí)，可與黑變的中間產(chǎn)物–醌類化合物發(fā)生反應(yīng)從而阻斷黑變發(fā)生，但亞硫酸鹽類在使用過程中往往存在過量使用、殘留超標(biāo)的問題，存在一定的安全隱患。

4-HR表現(xiàn)出很好的PO抑制效果，南極磷蝦和鷹爪糙對(duì)蝦PO經(jīng)4-HR處理后，相對(duì)酶活力僅有30.16%和19.75%。4-HR可競(jìng)爭(zhēng)性抑制PO，有效防止黑色素的形成(周宇芳等, 2019)。我國(guó)曾在20世紀(jì)90年代引進(jìn)了美國(guó)瑞輝公司的“蝦鮮寶”產(chǎn)品(殷邦忠等, 1994)，該產(chǎn)品的主要有效成份即4-HR，但4-HR成本相對(duì)較高，限制了其大范圍應(yīng)用推廣。

L-半胱氨酸和抗壞血酸也表現(xiàn)出較好的PO活力抑制效果?？箟难崾且环N強(qiáng)還原劑，可阻止底物被氧化成醌類以及醌類進(jìn)一步聚合成黑色素，從而抑制黑變。L-半胱氨酸則直接與酶促反應(yīng)的中間產(chǎn)物–醌類化合物結(jié)合生成無色的硫氫化合物(Soottawat, 2006)，從而阻斷黑變的發(fā)生。這2種化合物均對(duì)人體無毒副作用，在食品安全方面更符合要求。

圖3 化學(xué)試劑對(duì)南極磷蝦與鷹爪糙對(duì)蝦PO活力的影響

3 結(jié)論

冷藏條件下南極磷蝦與鷹爪糙對(duì)蝦黑變情況差異較大，南極磷蝦黑變更為迅速，這可能與其生存環(huán)境有關(guān)，經(jīng)過長(zhǎng)期的自然選擇，南極磷蝦更能適應(yīng)低溫環(huán)境，所以其PO在低溫條件下仍保持較高的活力。南極磷蝦和鷹爪糙對(duì)蝦PO的最適溫度分別為30℃、40℃，最適pH均在6.0~7.0范圍內(nèi)，酸性環(huán)境能較好地抑制其酶活，因此，在2種蝦的運(yùn)輸、保存過程中，可選擇添加一些酸性物質(zhì)來達(dá)到延長(zhǎng)其保鮮期的目的。焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、4-HR、L-半胱氨酸和抗壞血酸均表現(xiàn)出較好的PO活力抑制效果，適宜用來配制蝦類防黑變保鮮劑。

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Comparative Analysis of the Biochemical Properties of Phenoloxidase Isolated fromand

LIN Ruihuan1,2, ZHAO Ling2, CAO Rong2,3①, LIU Qi2

(1. College of Food Sciences and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 200090; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071; 3. Laboratory for Marine Drugs and Bioproducts, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071)

Melanosis is a prominent problem in the transportation and storage of Antarctic krill. In order to explore the similarities and differences in the process of melanosis between Antarctic krill and common sea shrimps,andwere selected as research objects. A sensory evaluation of the melanosis process of the two shrimps during storage at (2±1)℃ were observed. The phenoloxidase (PO) was extracted and purified from the two species, the biochemical properties of which were further examined and compared. The results showed that the black spot formation was more serious in Antarctic krill under cold conditions at 24 h, and large areas of black spots were concentrated in the cephalothorax, abdominal shell, and tail of Antarctic krill. For, slight black spots were observed in the cephalothorax and tail after 72 h, and then gradually spread to the whole body. The crude PO solutions of the two shrimp species were purified using ammonium sulfate and filtered through Sephadex G-100 gel. The purification fold of the PO solutions ofandreached 17.22 and 19.67, respectively. The optimum PO temperature was 30℃ forand 40℃ forrespectively. The PO activity of Antarctic krill was higher at low temperatures and that of sea catch shrimp was higher at high temperatures. The optimum pH was between 6.0 and 7.0 for both species. Sodium metabisulfite, sodium bisulfite, 4-HR, L-cysteine, and ascorbic acid can all effectively inhibit the PO activity of the two shrimp species. Among these chemical reagents, 4-HR showed the best inhibitory effect on PO activity. The findings in this paper may provide a basis for the quality control during cold chain logistics of Antarctic krill, and also provide a reference for effectively suppressing melanosis in shrimps after death.

Melanosis;;; Phenoloxidase

CAO Rong, E-mail: caorong@ysfri.ac.cn

S983

A

2095-9869(2021)02-0124-08

10.19663/j.issn2095-9869.20200211002

http://www.yykxjz.cn/

林瑞環(huán), 趙玲, 曹榮, 劉淇. 南極磷蝦與鷹爪糙對(duì)蝦酚氧化酶生化性質(zhì)對(duì)比分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2021, 42(2): 124–131

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* 山東省重大科技創(chuàng)新工程專項(xiàng)(2018SDKJ0304-2)和中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(20603022020013)共同資助 [This work was supported by the Key Science and Development Innovation Program of Shandong Province (2018SDKJ0304-2),and Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, YSFRI, CAFS (20603022020013)]. 林瑞環(huán)，E-mail: 2055853201@qq.com

曹 榮，副研究員，E-mail: caorong@ysfri.ac.cn

2020-02-11,

2020-03-02

(編輯 陳 輝)