董玲玲，高 云，牛國(guó)宇

(1.濰坊市中醫(yī)院 腫瘤中心； 2.濰坊醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生與管理學(xué)院, 山東 濰坊 261000)

上皮性卵巢癌(ovarian cancer)由于侵襲性較強(qiáng)，大多數(shù)患者被確診時(shí)已為晚期[1]。臨床迫切需要了解卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，并進(jìn)一步確定診斷和治療的分子標(biāo)記和靶點(diǎn)[2]。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor,CTGF)是一種屬于CCN家族的分泌蛋白，參與腫瘤的增殖、遷移、血管生成和轉(zhuǎn)移等[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)CTGF在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[5-6]，但具體機(jī)制不清。本研究采用rhCTGF刺激卵巢癌細(xì)胞SKOV3，觀察SKOV3的增殖、遷移能力以及EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，初步探索CTGF在卵巢癌中的作用，為卵巢癌尋找新的預(yù)后標(biāo)志物和分子治療靶點(diǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

重組人CTGF(rhCTGF)(PeproTech公司)；人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院腫瘤中心實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng))；CCK8試劑盒(日本同仁試劑公司)；Western blot相關(guān)抗體(Bioworld公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及處理:人卵巢癌細(xì)胞SKOV3培養(yǎng)于加雙抗的含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中。置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 胰蛋白酶消化傳代細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組用含rhCTGF(終濃度500 mg/L)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，對(duì)照組含同等量PBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖: 將SKOV3細(xì)胞接種在96孔板內(nèi), 5 000個(gè)/孔，第1～7天內(nèi)檢測(cè)。加入10% CCK8試劑后繼續(xù)培養(yǎng)2 h，在酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)各孔吸光度值(A)。

1.2.3 集落形成檢測(cè)細(xì)胞增殖: 接種SKOV3細(xì)胞500個(gè)/孔在6孔板，每組2個(gè)復(fù)孔。一般培養(yǎng)14 d內(nèi)。集落形成后停止培養(yǎng)，固定、染色、拍照。

1.2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力: 調(diào)整細(xì)胞密度為5.0×105個(gè)/孔接種于6孔板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到90%左右時(shí)，用200 μL槍頭劃線, PBS清洗3次。并于劃線后0、24和48 h后拍照記錄。

1.2.5 Western blot檢測(cè)蛋白: 將SKOV3細(xì)胞接種24 h板，完全匯合后rhCTGF處理24 h，提取細(xì)胞總蛋白,測(cè)定蛋白含量,制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、洗膜，脫脂奶粉封閉1 h，一抗孵育4 ℃過(guò)夜，二抗室溫反應(yīng)2 h，ECL曝光成像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 rhCTGF促進(jìn)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖

rhCTGF處理后，SKOV3細(xì)胞的增殖率高于對(duì)照組(P<0.05)(圖1A)。細(xì)胞培養(yǎng)14 d左右，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的克隆形成能力高于對(duì)照組(P<0.05)(圖1B，C)。

2.2 rhCTGF促進(jìn)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的遷移能力

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組SKOV3細(xì)胞的遷移率明顯提高(P<0.05)(圖2)。

2.3 rhCTGF影響EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)

rhCTGF處理后EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而 Vimentin蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with control group圖1 CCK8 法(A)和克隆形成實(shí)驗(yàn)(B,C)分別檢測(cè)SKOV3細(xì)胞的增殖和克隆形成能力

*P<0.05 compared with control group圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)SKOV3細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討論

上皮性卵巢癌是婦科腫瘤中致死性最高的惡性腫瘤。多年來(lái)，卵巢癌的治療得到長(zhǎng)足的進(jìn)展，但晚期卵巢癌的總體生存期仍不盡人意[7]。CTGF在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的作用被很多學(xué)者探索，部分學(xué)者認(rèn)為它在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起到抑制作用[8-9]，但近年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)表明它為促癌因子[10-11]。本研究利用外源性rhCTGF處理卵巢癌細(xì)胞SKOV3后細(xì)胞增殖及遷移能力明顯增強(qiáng)，E-cadherin表達(dá)下調(diào)，Vimentin的表達(dá)上調(diào)。綜上可見(jiàn)，CTGF可能通過(guò)誘導(dǎo)EMT促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖和遷移，有望成為上皮性卵巢癌新的預(yù)后標(biāo)記及分子靶向治療研究的新方向。