郭俊愷 趙承磊 趙興旺 王 娟 葛 蘭 宋志強(qiáng) 游 弋

陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，重慶，400038

干燥綜合征(Sjogren’s syndrome, SS)是一種慢性自身免疫性疾病，中年女性好發(fā)，發(fā)病率為0.1%～0.6%[1,2]。其臨床表現(xiàn)可分為兩類：外分泌腺表現(xiàn)和腺體外表現(xiàn)。外分泌腺主要累及淚腺和唾液腺，常引起眼、口干燥。腺體外可累及皮膚、關(guān)節(jié)、肺、胃、腎等臟器[3,4]。SS的病因目前尚不明確，可能與遺傳和環(huán)境因素的復(fù)雜相互作用有關(guān)，目前認(rèn)為SS與自身抗原Ro/SSA和La/SSB導(dǎo)致的異常免疫反應(yīng)有關(guān)[5-7]。

隨著高通量測(cè)序和微陣列技術(shù)的發(fā)展，生物信息學(xué)已用于篩選各種疾病中的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)[8]。為了深入探討SS的發(fā)病機(jī)制，本研究對(duì)基因數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的GSE23117和GSE127952的基因表達(dá)譜進(jìn)行了分析，鑒定關(guān)鍵DEGs，分析它們?cè)赟S發(fā)病過(guò)程中的潛在途徑，為研究SS的發(fā)生和發(fā)展提供一些新的思路。

1 材料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)信息 從基因數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI-GEO)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)獲得GSE23117和GSE127952的基因表達(dá)譜。GSE23117的數(shù)據(jù)來(lái)自GPL570平臺(tái)[Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array]的芯片，用于研究SS和非SS患者不同炎癥程度的小唾液腺的基因表達(dá)，我們分析其中10個(gè)SS小唾液腺標(biāo)本和4個(gè)健康對(duì)照小唾液腺樣本；GSE127952來(lái)自GPL20995平臺(tái)[Agilent-019415 Human and Custom Viral Transcript Array 1.2]的芯片，用于研究SS患者和健康志愿者在小唾液腺中基因表達(dá)譜的差異，包括8個(gè)SS小唾液腺樣本和6個(gè)健康對(duì)照小唾液腺樣本。NCBI-GEO屬于國(guó)際公共公開(kāi)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)，用于幫助科研工作者們查詢和下載實(shí)驗(yàn)以及精選的基因表達(dá)譜。

1.2 DEGs的數(shù)據(jù)提取 SS和健康對(duì)照腺體樣本的DEGs均來(lái)自GEO2R網(wǎng)站，取|logFC|>2，P值<0.05。logFC>2的DEGs被視為上調(diào)基因，而logFC<-2的DEGs被視為下調(diào)基因。用Venn在線工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)篩選出GSE23117和GSE127952中共同的上調(diào)和下調(diào)DEGs，并用Heml 1.0軟件分別繪制GSE23117和GSE127952共同DEGs的熱圖。

1.3 PPI圖譜和關(guān)鍵基因的獲取 使用在線工具STRING (https://string-db.org/)用于評(píng)估PPI網(wǎng)絡(luò)信息。然后通過(guò)下載Cytoscape軟件研究DEGs之間的潛在關(guān)系，利用Cytoscape軟件的MCODE(Degree Cutoff=2，Max. Depth=100, K-Core=2, Node Score cutoff=0.2)應(yīng)用程序來(lái)獲得關(guān)鍵的候選基因。最后應(yīng)用David Gene(http://david.abcc.ncifcrf.gov)功能分類工具分析GO和KEGG途徑。

2 結(jié)果

2.1 SS小唾液腺樣本中DEGs的鑒定 在這項(xiàng)研究中，我們分別對(duì)GSE23117(10個(gè)SS小唾液腺樣本和4個(gè)健康對(duì)照小唾液腺樣本)和GSE127952(8個(gè)SS小唾液腺樣本和6個(gè)健康對(duì)照小唾液腺樣本)的數(shù)據(jù)集進(jìn)行了分析。通過(guò)GEO2R在線工具，我們分別從GSE23117和GSE127952中提取了658和155個(gè)DEGs。利用Venn圖分析了31個(gè)重疊的DEGs，這些重疊基因包括28個(gè)上調(diào)基因和3個(gè)下調(diào)基因，并用Heml 1.0軟件繪制重疊DEGs熱圖(表1，圖1、2)。

縱軸代表基因，橫軸中SS為病例組，HC為對(duì)照組

表1 重疊的DEGs

2.2 功能和途徑的基因分析 使用David軟件探索31個(gè)DEGs的功能和途徑。功能分析的結(jié)果表明，在生物學(xué)過(guò)程(BP)中，上調(diào)的DEGs在炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、脂多糖反應(yīng)、白細(xì)胞趨化性正向調(diào)節(jié)、趨化因子介導(dǎo)的信號(hào)通路、細(xì)胞-細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、cAMP代謝過(guò)程正向調(diào)節(jié)、cAMP介導(dǎo)的信號(hào)傳遞正向調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)和干擾素-γ負(fù)向調(diào)節(jié)中聚集。在細(xì)胞成分(CC)分析中，上調(diào)的DEGs聚集在質(zhì)膜的外部和細(xì)胞外區(qū)域。在分子功能(MF)分析中，上調(diào)的DEGs在絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、趨化因子活性和CXCR趨化因子受體結(jié)合中富集(表2)。

表2 干燥綜合征功能的基因分析

2.3 KEGG分析的結(jié)果 分析結(jié)果提示在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用，趨化因子信號(hào)傳導(dǎo)途徑，阿米巴病和白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移等通路明顯富集(表3)。

表3 干燥綜合征差異表達(dá)基因的KEGG分析

2.4 PPI和模塊化圖片 建立DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)(圖3)。使用Cytoscape軟件MCODE應(yīng)用程序來(lái)顯示9個(gè)中心節(jié)點(diǎn)(CXCL9，CXCL11，CXCL13，CCR1，CD69，PTPRC，GPR183，MMP9和IL10)的結(jié)果(圖4)。

圓圈代表基因，線代表基因之間的PPI，圓圈內(nèi)的結(jié)果代表蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

方塊代表基因，結(jié)果顯示9個(gè)關(guān)鍵基因

3 討論

在本研究中，對(duì)BP的GO功能分析顯示，上調(diào)的DEGs主要集中在炎癥、免疫、對(duì)脂多糖(LPS)的反應(yīng)、白細(xì)胞趨化性的正調(diào)節(jié)和趨化因子介導(dǎo)的信號(hào)通路等方面。SS是一種與炎癥介質(zhì)、細(xì)胞浸潤(rùn)密切相關(guān)的自身免疫性疾病[9]。既往研究中LPS刺激唾液細(xì)胞可上調(diào)TLR 4的表達(dá)和免疫調(diào)節(jié)分子的表達(dá)，這在SS的唾液腺炎癥反應(yīng)中起著重要的作用[10]。SS患者唾液中細(xì)胞因子/趨化因子的濃度明顯高于對(duì)照組[11]。這與我們分析的結(jié)果類似。CC分析中，DEGs主要集中在細(xì)胞質(zhì)膜外區(qū)域和細(xì)胞外間隙。MF分析中，絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、趨化因子活性和CXCR趨化因子受體結(jié)合中富集。KEGG分析提示DEGs通路與細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子信號(hào)通路、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移和阿米巴病有關(guān)。SS發(fā)病機(jī)制的研究表明，T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞對(duì)自身抗原的異常反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞因子和趨化因子水平升高，引起腺泡慢性炎癥并最終導(dǎo)致其生理功能的喪失[7]。阿米巴滋養(yǎng)體可以誘導(dǎo)IL-10的產(chǎn)生[12]。IL-10的表達(dá)在抵抗阿米巴病侵襲的黏膜屏障中發(fā)揮重要的作用[13]。同時(shí)作為一種具有重要免疫調(diào)節(jié)功能的抗炎細(xì)胞因子，IL-10在SS患者的唾液腺中高表達(dá),通過(guò)釋放免疫介質(zhì)和抗原呈遞來(lái)抑制單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的免疫功能[14,15]。

PPI和模塊分析表明，CXCL9、CXCL11、CXCL13、CCR1、CD69、PTPRC、GPR183、MMP9和IL10基因顯著富集。這9個(gè)關(guān)鍵基因主要可以分為三大類：一是細(xì)胞因子及趨化因子基因，包括IL10、CXCL9、CXCL11、CXCL13、CCR1。IL10作為重要的抗炎細(xì)胞因子，在自身免疫疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[16]，IL-10的rs3024505變體是干燥綜合征的易感等位基因[17]。CXCL9、CXCL11、CXCL13屬于趨化因子配體家族，在SS患者唾液中濃度高出正常人，提示與唾液腺的大量淋巴細(xì)胞聚集密切相關(guān)[11]。CCR1是一種趨化因子受體，與細(xì)胞浸潤(rùn)、活化、組織損傷和炎癥有關(guān)。SS患者B淋巴細(xì)胞中CCR1的表達(dá)上調(diào)，可能與B淋巴細(xì)胞的干擾素信號(hào)有關(guān)[18]。在KEGG分析中，我們發(fā)現(xiàn)IL10、CXCL9、CXCL11、CXCL13和CCR1主要參與細(xì)胞因子與胞嘧啶受體的相互作用和趨化因子信號(hào)通路，這可能提示趨化因子在SS中的異常表達(dá)使外分泌細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致外分泌腺功能障礙[19]。二是免疫相關(guān)基因，包括CD69，MMP9。CD69是II型跨膜糖蛋白，與其交聯(lián)可產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)及多種免疫反應(yīng)，與血液系統(tǒng)疾病及免疫性相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理有關(guān)。SS患者中活化的CD3/CD69T細(xì)胞百分比增加，在組織的炎性級(jí)聯(lián)中起重要作用[20]。MMP9也稱為明膠酶B，屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族。MMP9基因被證明與自身免疫的病理生理過(guò)程有關(guān)[21]。MMP9的增加或許與唾液腺結(jié)構(gòu)完整性的退化有關(guān)，導(dǎo)致唾液生成減少[22]。三是其它基因，包括PTPRC，GPR183。PTPRC的蛋白質(zhì)產(chǎn)物是蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(PTP)家族的成員，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、有絲分裂和致癌轉(zhuǎn)化中起著重要作用[23]。PTPRC基因與SS有關(guān)，可能參與基因甲基化[24]。GPR183又稱EB病毒誘導(dǎo)分子2(EBI 2)，GPR183主要在B細(xì)胞中表達(dá)并誘導(dǎo)細(xì)胞遷移和增殖[25]。在SS患者腺上皮曾發(fā)現(xiàn)EB病毒顆粒,在SS患者血清中也發(fā)現(xiàn)過(guò)EB病毒抗體[26]。我們的研究一定程度上支持病毒感染可能是SS的激發(fā)因素。

綜上所述，DEGs主要通過(guò)細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子信號(hào)通路等調(diào)控炎癥、免疫參與SS的發(fā)病機(jī)制。我們推測(cè)篩選的9個(gè)關(guān)鍵DEGs在SS的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，可能為研究SS的表面靶點(diǎn)和生物學(xué)機(jī)制提供一些新思路和方向。