韓 露 周 揚(yáng) 段行武 陳 兵 方如男 李建紅

北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院，北京，100700

銀屑病是一種以紅斑、鱗屑為主要表現(xiàn)的慢性炎癥性皮膚病，其特征性病理改變?yōu)槌掷m(xù)性炎癥以及角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocytes，KCs)增殖失控和分化障礙[1]。銀屑病皮損組織中KCs的增殖速度是正常表皮的2倍，而其細(xì)胞周期縮短到正常周期的1/8[2]，可見(jiàn)KCs的異常增殖與細(xì)胞周期紊亂密切相關(guān)。細(xì)胞分裂周期蛋白(cell division cycle protein，cdc)7是細(xì)胞周期中最重要的調(diào)節(jié)因子之一，TAK-931則是一種cdc7選擇性抑制劑，具有顯著的抗增殖活性[3]。盡管目前沒(méi)有cdc7與銀屑病發(fā)病的相關(guān)報(bào)道，但有皮膚腫瘤方面的研究顯示cdc7在黑素瘤組織中高表達(dá)，而TAK-931可有效抑制黑素瘤進(jìn)展[4]，提示我們cdc7在皮膚組織中發(fā)揮重要作用，且與表皮角質(zhì)細(xì)胞增殖密切相關(guān)。銀屑病是KCs過(guò)度增生性疾病，我們先期的預(yù)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，在銀屑病體內(nèi)外模型中cdc7呈過(guò)度表達(dá)，提示 cdc7可能與銀屑病 KCs 異常增殖之間有密切聯(lián)系。

消銀解毒飲根據(jù)東直門(mén)醫(yī)院金起鳳教授創(chuàng)立的經(jīng)驗(yàn)方“消銀解毒湯”研制，臨床應(yīng)用多年，治療銀屑病血熱證療效確切[5]。先期研究顯示消銀解毒飲可以通過(guò)抑制KCs增殖治療銀屑病[6,7]，然而其抑制KCs增殖的作用是否通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控仍需進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)擬建立咪喹莫特(imiquimod，IMQ)誘導(dǎo)的小鼠銀屑病模型，觀(guān)測(cè)用藥前后小鼠銀屑病皮損表現(xiàn)、表皮病理改變、皮膚組織cdc7表達(dá)情況，從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平探討消銀解毒飲通過(guò)cdc7抑制角質(zhì)細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性BALB/c小鼠20只，8周齡，體重20 g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK(遼) 2020-0001。

1.2 藥物 院內(nèi)制劑消銀解毒飲(水牛角30 g，生地15 g，丹皮12 g，土茯苓30 g，苦參10 g，紫草15 g，生甘草6 g等)由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院顆粒藥房提供。按照小鼠劑量(20 g體重)=9.1×成人劑量(70 kg體重)，得到小鼠灌胃劑量為23.4 g/kg，雙蒸水溶解，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑 cdc7抑制劑TAK-931(MCE，貨號(hào)：HY-100888)；5%咪喹莫特乳膏(明欣藥業(yè)，貨號(hào)：74969)；異氟烷(瑞沃德，貨號(hào)：217180101)；蘇木素(Sigma，貨號(hào)：H9627)；伊紅Y(水溶性)(國(guó)藥集團(tuán)，貨號(hào)：71014544)；無(wú)水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)，貨號(hào)：10009218)；二甲苯(國(guó)藥集團(tuán)，貨號(hào)：10023418)；包埋石蠟(國(guó)藥集團(tuán)，貨號(hào)：69019361)；中性樹(shù)膠(國(guó)藥集團(tuán)，貨號(hào)：10004160)；正常山羊血清(博士德生物，貨號(hào)：15GO6AC9)；Dako免疫組化試劑盒(安捷倫，貨號(hào)：K5007)；重組Anti-CDC7抗體(abcam，貨號(hào)：ab229187)。

1.4 儀器 病理切片機(jī)(德國(guó)Leica，型號(hào)：RM 2016)；脫水機(jī)(武漢俊杰，型號(hào)：JT-12J)；組織攤烤片機(jī)(武漢俊杰，型號(hào)：JK-6)；顯微鏡(奧林巴斯，型號(hào)：BX53)。

1.5 分組及造模

1.5.1 建立動(dòng)物模型[8，9]將20只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后，隨機(jī)分為4組，每組5只：①對(duì)照組；②銀屑病模型組；③消銀解毒飲組；④TAK-931組。實(shí)驗(yàn)前所有小鼠予異氟烷吸入麻醉，除去背部毛發(fā)，形成約2 cm×3 cm皮膚暴露區(qū)域。②③④組每只小鼠每日涂抹含5% IMQ的膏霜50 mg，①組小鼠只進(jìn)行等量凡士林涂抹處理，連續(xù)涂抹5天。

1.5.2 實(shí)驗(yàn)給藥 ①②組小鼠蒸餾水灌胃；③組每天進(jìn)行消銀解毒飲灌胃處理(每次23.4 g/kg)；④組每天進(jìn)行TAK-931灌胃處理(每次2 mg/kg)。所有動(dòng)物給藥容量是每次10 mL/kg，每天2次，造模當(dāng)天開(kāi)始給藥，連續(xù)5天。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.6.1 小鼠銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度評(píng)估 第1～5天涂抹IMQ前及第6天，每天對(duì)小鼠背部皮膚暴露區(qū)域進(jìn)行單獨(dú)拍照處理，動(dòng)態(tài)觀(guān)察皮損進(jìn)展情況，依據(jù)銀屑病皮損面積與嚴(yán)重程度指數(shù)(psoriasis area and severity index，PASI)評(píng)價(jià)辦法[10]，對(duì)小鼠皮損處紅斑、鱗屑及浸潤(rùn)增厚程度進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0分(無(wú))；1分(輕度)；2分(中度)；3分(重度)；4分(極重度)。將三者相加得到總積分，對(duì)各組小鼠的總積分取均值后繪制趨勢(shì)圖。

1.6.2 HE染色觀(guān)察小鼠皮膚組織形態(tài)學(xué)改變 于造模第6天，處死小鼠取其背部皮膚組織，經(jīng)脫水、透明處理后，進(jìn)行石蠟包埋，制成4 μm厚的切片。切片脫蠟，入蘇木素染液染色5 min，沖洗后入1%水溶性伊紅染液染色5 min，以中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下采集圖像，觀(guān)察各組小鼠皮膚組織病理學(xué)變化，并采用ImageJ軟件測(cè)量表皮厚度。

1.6.3 免疫組化檢測(cè)小鼠皮膚組織中cdc7表達(dá) 皮膚組織切片脫蠟、水化、抗原修復(fù)后，滴加3%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，以正常山羊血清封閉30 min，cdc7抗體(1∶100)4℃孵育過(guò)夜，酶標(biāo)二抗37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水后以中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下采集圖像，檢測(cè)各組小鼠皮膚組織cdc7表達(dá)情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，PASI評(píng)分采用秩和檢驗(yàn)(Kruskal-wallis)進(jìn)行組間比較，表皮厚度、cdc7陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD進(jìn)行比較，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 消銀解毒飲對(duì)小鼠銀屑病模型皮膚的影響 從每日皮損變化觀(guān)察得到，對(duì)照組小鼠皮膚無(wú)紅斑、無(wú)鱗屑、無(wú)增厚改變；造模后小鼠皮膚逐漸出現(xiàn)紅斑，且皮膚不斷增厚，第3天出現(xiàn)鱗屑表征，第6天時(shí)，背部皮膚紅斑明顯，布滿(mǎn)層狀鱗屑，易脫落，皮膚高度增厚；與銀屑病模型組相比，消銀解毒飲組和TAK-931組皮損進(jìn)展較慢，鱗屑明顯減少，紅斑面積較小、顏色較淡，皮損肥厚程度不明顯，見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠背部皮損表現(xiàn)

PASI評(píng)分結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，模型組小鼠第2天起即有皮膚增厚表現(xiàn)，隨抹藥天數(shù)的增加，總評(píng)分呈上升趨勢(shì)，表明皮損不斷加重，其中第2～3天及第4～5天評(píng)分上升幅度最大；與模型組相比，消銀解毒飲組和TAK-931組總評(píng)分明顯減低，增高速度緩慢，表明消銀解毒飲組與TAK-931組皮損進(jìn)展較慢，紅斑、鱗屑、皮損增厚程度較輕，見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠皮損PASI評(píng)分

2.2 消銀解毒飲對(duì)小鼠銀屑病模型皮膚組織形態(tài)學(xué)影響 HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠表皮層薄，無(wú)增厚改變，細(xì)胞浸潤(rùn)少；銀屑病模型組小鼠表皮增生明顯，同時(shí)存在角化過(guò)度與角化不全，棘細(xì)胞層增厚，角質(zhì)層可見(jiàn)Munro微膿腫，真皮層有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與銀屑病模型組相比，消銀解毒飲組和TAK-931組皮損區(qū)域表皮增生較輕，真皮層炎性細(xì)胞數(shù)目較少，見(jiàn)圖3。

3a：對(duì)照組；3b銀屑病模型組；3c消銀解毒飲組；3d：TAK-931組；黑色箭頭：表皮增生；藍(lán)色箭頭：炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(HE，×200)

使用ImageJ軟件測(cè)量HE染色后各組表皮厚度，銀屑病模型組明顯較對(duì)照組表皮增厚(P<0.01)，消銀解毒飲組(P<0.01)和TAK-931組(P<0.05)表皮增厚程度均低于模型組，其中消銀解毒飲組對(duì)表皮增生的改善作用更明顯,但二組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖4。

(**表示P<0.01，*表示P<0.05)

2.3 消銀解毒飲對(duì)小鼠銀屑病模型皮膚組織中cdc7表達(dá)的影響 免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組表皮較少見(jiàn)cdc7陽(yáng)性細(xì)胞；與對(duì)照組相比，模型組表皮cdc7陽(yáng)性細(xì)胞顯著增多(P<0.01)，主要分布于基底層，棘層亦有分布；消銀解毒飲組表皮cdc7陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較模型組明顯減少(P<0.05)，見(jiàn)圖5、6。

5a：對(duì)照組；5b：銀屑病模型組；5c：消銀解毒飲組

(**表示P<0.01，*表示P<0.05)

3 討論

銀屑病的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前較為公認(rèn)的發(fā)病模型認(rèn)為，當(dāng)皮膚感染或損傷時(shí)，角質(zhì)細(xì)胞釋放抗菌肽并與自身遺傳物質(zhì)相結(jié)合，激活樹(shù)突狀細(xì)胞，產(chǎn)生TNF-α、IL-23等細(xì)胞因子，介導(dǎo)Th17細(xì)胞的分化。成熟的Th17細(xì)胞分泌IL-17、IL-22、IL-23等炎性反應(yīng)因子激活KCs的增殖。KCs過(guò)度增殖又分泌多種細(xì)胞因子、趨化因子和抗菌肽等物質(zhì)趨化Th17等炎癥細(xì)胞至皮膚，從而形成了促進(jìn)銀屑病發(fā)生發(fā)展的正反饋環(huán)路[11,12]。由此可見(jiàn)，KCs過(guò)度增殖在銀屑病的發(fā)生和維持中都起重要作用。

cdc7是細(xì)胞周期中必需的一種激酶，特別調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的G1/S相變，而G1/S相變是細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)。cdc7在與其調(diào)節(jié)亞基DBF4結(jié)合后形成活性激酶復(fù)合體(DBF4-dependent kinase，DDK)，使其下游效應(yīng)分子微小染色體效應(yīng)維持蛋白(mini chromosome maintenance protein，MCM)2-7磷酸化，從而激活解旋酶活性，開(kāi)啟DNA復(fù)制的第一步[3,13]。而KCs的異常增殖與細(xì)胞周期紊亂密切相關(guān)[2]，依此推測(cè)cdc7對(duì)細(xì)胞周期DNA復(fù)制起始的調(diào)控可能參與銀屑病KCs異常增殖的病理過(guò)程。

在本次研究中，與對(duì)照組相比模型組小鼠皮膚經(jīng)IMQ誘導(dǎo)后出現(xiàn)紅斑、鱗屑、皮膚增厚改變，同時(shí)HE染色觀(guān)察小鼠皮損組織形態(tài)學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠表皮增生明顯，棘細(xì)胞層增厚，真皮層有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以上均符合銀屑病臨床及病理表現(xiàn)。在應(yīng)用cdc7抑制劑TAK-931后，對(duì)小鼠皮損PASI評(píng)分有較為明顯的改善作用，HE染色結(jié)果顯示，TAK-931可以減輕銀屑病模型表皮增生程度，減輕炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。說(shuō)明cdc7對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控作用可以促進(jìn)銀屑病KCs的異常增殖，通過(guò)抑制cdc7可以有效干預(yù)小鼠銀屑病模型進(jìn)展。

我院制劑消銀解毒飲由水牛角、生地、牡丹皮、赤芍、金銀花等藥物組成，有涼血清熱、解毒化斑、泄?jié)裰拱W的作用，臨床研究顯示，其治療銀屑病血熱證的總有效率為91.8%，療效確切[5]。我科前期研究采用藥理血清的方法，以角質(zhì)形成細(xì)胞株 COLO-16為研究對(duì)象，觀(guān)察消銀解毒飲及拆方后各組藥物血清對(duì)KCs增殖的影響，發(fā)現(xiàn)消銀解毒飲可直接抑制KCs過(guò)度增殖以及誘導(dǎo)其凋亡，并且可以抑制角質(zhì)形成細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，從而發(fā)揮對(duì)銀屑病的治療作用[6,7,14]。本研究使用消銀解毒飲干預(yù)小鼠銀屑病模型，發(fā)現(xiàn)消銀解毒飲可以明顯改善小鼠皮損PASI評(píng)分及組織病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)；免疫組化法檢測(cè)結(jié)果顯示，消銀解毒飲可以顯著降低小鼠銀屑病模型表皮cdc7陽(yáng)性細(xì)胞的水平。

綜上所述，cdc7可以促進(jìn)銀屑病KCs的異常增殖，消銀解毒飲可能通過(guò)下調(diào)cdc7表達(dá)，抑制KCs的過(guò)度增殖，發(fā)揮對(duì)銀屑病的治療作用。然而，本研究尚處于消銀解毒飲通過(guò)cdc7抑制角質(zhì)細(xì)胞增殖研究的初級(jí)階段，關(guān)于其作用機(jī)制尤其是具體信號(hào)通路的具體調(diào)控過(guò)程仍亟待進(jìn)一步闡明。