于學(xué)萍 孫勇虎 施仲香 周桂芝 劉 紅 張福仁

1濱州醫(yī)學(xué)院，山東煙臺，264033；2山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬皮膚病醫(yī)院(山東省皮膚病醫(yī)院，山東省皮膚病性病防治研究所)，山東濟(jì)南，250022

先天性大皰性魚鱗病樣紅皮病(bullous ichthyosiform erythroderma, BCIE)是一種罕見的常染色體顯性遺傳皮膚病，發(fā)病率1/400000～1/100000[1]，約50%有陽性家族史[2]?；颊叩钠つw損害多出現(xiàn)于出生時或出生后不久[2],通常臨床表現(xiàn)為出生時即有水皰、鱗屑及紅皮癥，以后發(fā)展為廣泛的角化過度，主要累及四肢屈側(cè)皮膚，呈灰棕色厚積鱗屑[3]。先前研究表明BCIE是由角蛋白1或10基因(Keratin, KRT)突變引起[1],突變頻率約50%[4]。本研究報(bào)道BCIE散發(fā)病例1例，通過PCR擴(kuò)增和Sanger直接測序法對KRT1及KRT10基因進(jìn)行突變檢測。

1 對象與方法

1.1 研究對象 我院皮膚科門診經(jīng)臨床及組織病理確診的1例BCIE患者。先證者，女，6歲。自幼雙下肢皮膚增厚、皸裂、干燥，后波及全身皮膚，以雙下肢為甚，自覺皮膚緊繃干燥，冬重夏輕，皮損漸重，融合成片(圖1)。皮膚科情況：皮膚干燥，軀干、四肢可見褐色黏著性斑片，皮疹邊界不清。組織病理示：基底層以上棘層松解、細(xì)胞破壞、空泡變性，表皮內(nèi)裂隙形成顆粒層細(xì)胞變性“有大而深染嗜堿顆?！?，角質(zhì)層增厚(圖2a)，DIF顯示：表皮細(xì)胞間及基底膜IgG、C3、IgM、IgA陰性(圖2b)。根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)及病理結(jié)果，診斷為先天性大皰性魚鱗病樣紅皮病。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取 本研究經(jīng)山東省皮膚病性病防治研究所倫理委員會批準(zhǔn)，簽署知情同意書后，抽取患者及其家屬外周血5 mL，同時采集100名無親緣關(guān)系的正常個體外周血5 mL作為對照，-80℃保存。采用DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)提取基因組DNA，并用全波長紫外/可見光掃描分光光度計(jì)ND-8000(Thermo Fisher公司，美國)測定其純度及含量，將其標(biāo)化為30 ng/μL的DNA模板。

1.2.2 根據(jù)既往報(bào)道的文獻(xiàn)設(shè)計(jì)特異性引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增KRT1及KRT10基因全部外顯子及側(cè)翼序列[3]，引物交由北京華大基因科技有限公司合成。25 μL PCR反應(yīng)體系為:PCR taq mix 12.5 μL，dNTP上下游引物各1 μL，DNA模板(30 ng/μL)0.5 μL，ddH2O 10 μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃ 10 min，變性94℃ 30 s，退火55℃～59℃ 45 s，延伸72℃ 10 min，共進(jìn)行 35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 DNA 測序 PCR產(chǎn)物經(jīng)醋酸鈉-乙醇沉淀法純化后直接于ABI 3130XL基因分析儀(Applied Bio-systems，美國)上進(jìn)行測序。

1.2.4 突變分析 所有測序結(jié)果經(jīng)NCBI blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析比對，用SIFT及Polyphen-2軟件對基因突變進(jìn)行功能預(yù)測。

2 結(jié)果

除KRT10基因7號外顯子無法擴(kuò)增出目的條帶外，患者KRT1、KRT10基因的其他外顯子經(jīng)PCR后直接測序，KRT1未檢測到突變，KRT10的1號外顯子第467位存在一雜合點(diǎn)突變，使CGC→CAC,導(dǎo)致KRT10基因所編碼的蛋白第156位氨基酸酸由精氨酸(R)變?yōu)榻M氨酸(H)，即P.R156H，結(jié)果均經(jīng)反向測序證實(shí)。而家系中非患者及100名正常對照均無此點(diǎn)突變(圖3)。

3a：先證者；3b：先證者母親；3c：先證者父親

利用SIFT及Polyphen-2 (http：//genetics.bwh.harvard.edu)對非同義突變對蛋白質(zhì)的影響進(jìn)行分析，以上軟件預(yù)測表明突變p.R156H對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響均為“damaging”。

檢索 Pubmed 和萬方數(shù)據(jù)庫至今發(fā)表的有關(guān)本病KRT1及KRT10基因突變的文章，其中在2000年報(bào)道了一個日本家系中BCIE患者，與本研究中的患者攜帶相同突變基因[5]。分別于2002年[6]和2011[7]年在兩例中國患者中均發(fā)現(xiàn)第156位氨基酸的突變，由于第467位堿基發(fā)生G→A雜合突變(c.467G>A) ，而使精氨酸變?yōu)榻M氨酸(p.R156H)。

3 討論

BCIE是角蛋白相關(guān)遺傳性皮膚病的一種，連鎖分析已證實(shí)為角蛋白K1或K10基因突變所致，Mayuzumi等[5]報(bào)道的該突變都發(fā)生于白種人，對于亞洲人群中這些基因突變的發(fā)生率還知之甚少。K1和K10在分化層的角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)配對表達(dá)，構(gòu)成角質(zhì)形成細(xì)胞的骨架[1]，它們的正常表達(dá)對保護(hù)機(jī)體抵御外界刺激，維持細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)及細(xì)胞間的黏著起重要作用[2]。K1和K10的突變可以引起角蛋白中間絲的結(jié)構(gòu)、排列或聚集異常，引起角化過度、細(xì)胞內(nèi)水腫，從而導(dǎo)致BCIE[8]。另外，K1和K10蛋白還可以抑制細(xì)胞增殖，因此，BCIE后期的主要表現(xiàn)為角化過度，可能是由于缺乏抑制作用[9]。K1和K10分為螺旋桿狀區(qū)、非螺旋的頭區(qū)和尾區(qū)及連接區(qū)，桿區(qū)又分為1A、1B、2A、2B四個功能區(qū)，其間由L1、L12、L2三個非螺旋區(qū)鏈接，在1A起始區(qū)(HIP)及2B結(jié)尾區(qū)(HTP)有兩個高度保守的區(qū)域,均由20個氨基酸組成[9]，目前公認(rèn)的致病突變的“熱點(diǎn)”區(qū)域包括：1A中的H1和HIP，L2和HTP。另外，根據(jù)突變位置的不同，臨床表現(xiàn)及皮損輕重程度均有較大差別[2]。

本文報(bào)道患者其臨床表現(xiàn)及組織病理均符合BCIE的診斷。對K1/K10基因進(jìn)行Sanger測序發(fā)現(xiàn)，KRT10的1號外顯子存在錯義突變，即c.467G>A(p.R156H)?；颊吒改讣罢φ照邿o此替代，說明是突變而不是單核苷酸多態(tài)性[2]?；颊邿o家族史，說明可能為家族中的新發(fā)病例。

K10第156位氨基酸(即1A起始區(qū)的第10個殘基)的突變是該基因熱點(diǎn)突變中的熱點(diǎn)。此位點(diǎn)上的突變已在多個種族的BCIE患者中被發(fā)現(xiàn),此位點(diǎn)對于角蛋白中間絲結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定至關(guān)重要[3,10]。Haruna等[11]分析總結(jié)了31例因K10第156位氨基酸突變引起的BCIE患者的臨床表型,其中23例患者表現(xiàn)為嚴(yán)重的臨床表型，另外6例表現(xiàn)為輕度的臨床癥狀。因此K10基因中第156(R156)位精氨酸殘基是高度保守的，其錯義突變可引起多數(shù)患者較嚴(yán)重的臨床表型[9,12]。此位點(diǎn)的精氨酸、組氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、脯氨酸、絲氨酸的替代也均有報(bào)道。孫秀坤等[3]對國內(nèi)兩例BCIE患者的研究中，發(fā)現(xiàn)兩例患者均在K10 156位氨基酸上發(fā)生突變，其中突變型為R156P的患者臨床表現(xiàn)嚴(yán)重，而突變型為R156H的患者僅有輕微的臨床癥狀。因此即使突變發(fā)生在同一位點(diǎn)，但替代的氨基酸不同，所致的臨床表現(xiàn)也不同。兩個氨基酸功能相差越大，經(jīng)替代后的蛋白結(jié)構(gòu)也就相差越大，疾病表型也越嚴(yán)重。先前文獻(xiàn)報(bào)道，K10基因突變所致的BCIE患者一般不累及掌跖部位，本例患者也符合此特征。而K1在掌跖部位的角質(zhì)形成細(xì)胞中有表達(dá)，因此累及掌跖部位的BCIE患者多是由K1基因突變所導(dǎo)致的[2]。

該病目前無特效藥物治療，主要給予長期口服阿維A及外用潤膚劑、維A酸、角化劑和維生素D的類似物等治療[13,14]。對受影響個體的父母和具有相似背景的病例可以接受必要的基因檢測和遺傳咨詢。本研究為基因診斷和基因治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和診斷依據(jù)，并為進(jìn)一步研究KRT10基因突變與BCIE的關(guān)系提供了依據(jù)。