楊 婷，于景翠

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院科研實驗中心，黑龍江 哈爾濱 150081

線粒體是細胞進行有氧呼吸、鈣信號傳導(dǎo)、細胞代謝調(diào)節(jié)、血紅素合成、類固醇合成以及細胞凋亡的關(guān)鍵場所[1]。線粒體較為獨特，有自己的基因組，同時受兩套遺傳體系即核基因組(nuclear DNA，nDNA)和線粒體基因組(mitochondrial DNA，mtDNA)的共同調(diào)控。雖然mtDNA只編碼13種多肽，但他們是細胞能量生成的關(guān)鍵組成部分[2]。在哺乳動物細胞中，線粒體可以通過氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPHOS)提供大部分能量[3]。除此之外，線粒體也是產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)的主要場所，ROS可以調(diào)節(jié)細胞功能，包括自噬和抗菌作用，并在細胞分化等途徑中充當(dāng)信號分子。生理條件下，細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和降解之間處于平衡狀態(tài)，但若線粒體功能障礙導(dǎo)致OXPHOS系統(tǒng)效率低下，產(chǎn)生高水平的ROS，并且由于mtDNA自身的結(jié)構(gòu)特征，會造成mtDNA的氧化損傷和/或發(fā)生突變，影響細胞的正常功能，從而引發(fā)包括腫瘤在內(nèi)的一些相關(guān)疾病[4-6]。

1 mtDNA結(jié)構(gòu)特征

mtDNA是長約16.5 kb的雙鏈環(huán)狀DNA，由編碼區(qū)和非編碼區(qū)組成[7]。編碼區(qū)共編碼包括22種轉(zhuǎn)運RNA、13種多肽、2種核糖體RNA在內(nèi)的37個基因；13種多肽包括復(fù)合體Ⅰ中的7種亞基(ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6)，復(fù)合體Ⅳ中的3種亞基(COXⅠ、COXⅡ、COXⅢ)，復(fù)合體Ⅴ中的2種亞基(ATP合成酶6和ATP合成酶8)和復(fù)合體Ⅲ中的細胞色素b(cytb)[8]。非編碼區(qū)也稱D-環(huán)區(qū)(D-loop)，是mtDNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的調(diào)控區(qū)域[9]；盡管D-loop區(qū)在mtDNA中的占比很少，卻是mtDNA突變的熱點區(qū)域，包含3個高變區(qū)(hypervariable regions,HVR)：位于mtDNA序列上(np)16024～16383的HVRⅠ、(np)57～372的HVRⅡ和(np)438～574的HVRⅢ[10]。

哺乳動物每個細胞的線粒體基質(zhì)中含有幾千個mtDNA拷貝，這為mtDNA的高突變率提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[11]。傳統(tǒng)意義上認(rèn)為與nDNA相比，mtDNA由于分子量小、缺乏組蛋白的保護、長期暴露于ROS的環(huán)境中、缺乏有效的修復(fù)機制，因此mtDNA易受ROS的損傷而發(fā)生變異[12]。雖然近年來也發(fā)現(xiàn)線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)發(fā)揮類似組蛋白的保護作用，盡管線粒體缺乏核苷酸切除修復(fù)(NER)和有效的同源重組，但保留了堿基切除修復(fù)(BER)和單鏈斷裂修復(fù)機制。盡管如此，研究發(fā)現(xiàn)mtDNA仍具有高突變率，導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生[13]。此外，在整個細胞周期過程中mtDNA始終處于合成狀態(tài)，穩(wěn)定性差，容易受到外界干擾而發(fā)生變異；且參與mtDNA復(fù)制的DNA聚合酶γ的校對能力較差，位于輕鏈復(fù)制起源部位的tRNA基因序列易形成發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)使得mtDNA復(fù)制的錯配率明顯提高[14-15]。mtDNA無內(nèi)含子，基因間隔近，有些區(qū)域呈現(xiàn)重疊[16]。

mtDNA的這些結(jié)構(gòu)特征使其自身更容易受環(huán)境影響而發(fā)生突變，mtDNA任何位點的突變均可能會影響線粒體的氧化磷酸化功能，使線粒體呼吸鏈功能障礙從而導(dǎo)致包括胃癌在內(nèi)的腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17]。

2 mtDNA變異與胃癌的關(guān)聯(lián)

胃癌的復(fù)雜演變過程不僅與癌基因和抑癌基因的改變有關(guān)，還與mtDNA的變異相關(guān)[18]。目前已在胃癌中檢測出幾種類型的mtDNA變異，包括點突變、插入、缺失和拷貝數(shù)變化。

2.1 mtDNA點突變與胃癌大量關(guān)于體細胞變異的研究均發(fā)現(xiàn)D-loop區(qū)域是體細胞變異的熱點區(qū)域[19]。Lee等[20]采用測序分析31例胃癌組織，發(fā)現(xiàn)有20例胃癌至少攜帶一個mtDNA體細胞突變位點，其中69%的突變發(fā)生在mtDNA D-loop區(qū)域，27%在蛋白質(zhì)編碼區(qū)域，4%位于tRNA基因中。發(fā)生在mtDNA D-loop區(qū)點突變的頻率為4%～48%，其中最常見的點突變位于mtDNA D-loop區(qū)上核苷酸位置303～309 np(D310區(qū))的poly-C序列堿基[21]。有分析認(rèn)為，由于在線粒體中缺乏有效的類似nDNA所具有的多種DNA修復(fù)機制，從而導(dǎo)致在癌癥中高頻率發(fā)生D310區(qū)突變[22]。此外，對poly-C重復(fù)序列的氧化損傷還會降低線粒體DNA聚合酶γ在復(fù)制和修復(fù)mtDNA過程中的準(zhǔn)確性，使核苷酸錯誤插入率升高，進而導(dǎo)致細胞的mtDNA發(fā)生點突變[23]。

在胃癌中除了D-loop區(qū)，mtDNA編碼區(qū)也存在體細胞突變。Hung等利用測序技術(shù)分析31例胃癌組織，其中7例癌組織mtDNA編碼區(qū)中有8個體細胞突變，包括同質(zhì)性5個點突變(G3697A、G4996A、G9986A、C12405T、T13015C)和異質(zhì)性3個突變(5895delC、7472insC、12418insA)，這些突變中有4個(4/8，50%)在mtDNA高度保守區(qū)域可導(dǎo)致氨基酸改變，可能引發(fā)線粒體功能障礙[24]。

2.2 mtDNA插入與胃癌在mtDNA D-loop區(qū)發(fā)生的串聯(lián)重復(fù)序列插入已經(jīng)在線粒體肌病、老年受試者和具有特定mtDNA單倍群的高加索人群中被檢出，由于所發(fā)現(xiàn)的大部分mtDNA插入突變呈隨機性，因此有研究者[25-26]認(rèn)為在腫瘤中檢測出的mtDNA D-loop區(qū)重復(fù)性插入并非癌癥特異性的。Wu等[25]采用PCR和測序分析31例胃癌組織，發(fā)現(xiàn)1例mtDNA D-loop區(qū)有一個約260 bp的串聯(lián)重復(fù)插入片段，其兩側(cè)分別是位于(np)303～309和(np)568～573的poly-C序列。同樣，Hung等[26]在約5%患有不同類型癌癥(包括胃癌)患者的癌組織中檢測出mtDNA的串聯(lián)重復(fù)或三聯(lián)重復(fù)，但在癌癥患者相應(yīng)的非癌組織和正常受試者的外周血細胞中也檢測出該串聯(lián)重復(fù)或三聯(lián)重復(fù)，因此認(rèn)為在mtDNA D-loop區(qū)域中發(fā)生的串聯(lián)重復(fù)或三聯(lián)重復(fù)是不特定于癌癥的；此外，研究者還發(fā)現(xiàn)mtDNA中的串聯(lián)重復(fù)或三聯(lián)重復(fù)與D-loop中的(np)568附近poly-C延伸區(qū)的長度變化密切相關(guān)。

2.3 mtDNA缺失與胃癌迄今為止，人們已經(jīng)在腫瘤中發(fā)現(xiàn)了大量的mtDNA缺失，最常見的是mtDNA 4 977 bp大片段缺失[27]。經(jīng)定量PCR和測序技術(shù)比對分析52例胃癌組織及相應(yīng)癌旁組織、13株胃癌細胞系的mtDNA 4 977 bp缺失，缺失率分別為73.1%、52%和92.3%，提示我們發(fā)生在mtDNA的大片段缺失對胃癌有一定的影響[28]。而與之相反的結(jié)果，Wu等在胃癌組織中檢測出4 977 bp的缺失率為9.7%，正常組織為55%[25]。同樣，Dani等[29]發(fā)現(xiàn)，胃癌組織mtDNA 4 977 bp缺失率明顯低于癌旁組織，推測mtDNA 4 977 bp大片段缺失可能會抑制癌細胞的增殖。對于上述的爭議性結(jié)果，有分析認(rèn)為，盡管隨著年齡的增長，mtDNA大片段缺失會在體細胞中逐漸積累，且環(huán)境因素(例如陽光照射)也會增加mtDNA缺失水平[30]。然而，在大多數(shù)腫瘤組織中mtDNA缺失水平明顯低于相應(yīng)癌旁組織的這種現(xiàn)象提示mtDNA的大片段缺失可能發(fā)生在細胞轉(zhuǎn)化之前或腫瘤發(fā)生的早期階段，并且因mtDNA大片段缺失可能使腫瘤細胞對凋亡更敏感，從而消除了mtDNA缺失水平高的腫瘤細胞[31]。除了mtDNA大片段缺失之外，一些較小的mtDNA缺失片段(<1 kb)似乎在腫瘤組織中會大量積累，而在同一患者的鄰近非腫瘤組織中不積累。通過采用PCR-SSCP技術(shù)分析77例胃癌組織中mtDNA D-loop區(qū)，Burgart等發(fā)現(xiàn)4例發(fā)生在胃-食管交界處的癌組織中均存在一個高水平的50 bp片段缺失，其側(cè)翼是D-loop區(qū)(np)298～306和(np)348～356的9 bp重復(fù)序列，而在淋巴細胞和其遠端的胃黏膜和組織中未發(fā)現(xiàn)該缺失[32]。

2.4 mtDNA拷貝數(shù)變化與胃癌目前，mtDNA拷貝數(shù)的變化已被發(fā)現(xiàn)包括胃癌在內(nèi)的多種類型腫瘤中，mtDNA拷貝數(shù)既有高也有低，但究竟是mtDNA含量的升高還是降低是決定腫瘤發(fā)生發(fā)展的危險因素尚無明確定論。Wen等采用定量PCR技術(shù)檢測了76例胃癌組織，結(jié)果顯示腫瘤組織中相對mtDNA拷貝數(shù)明顯少于相應(yīng)癌旁組織，ATP產(chǎn)物也顯著減少，認(rèn)為mtDNA拷貝數(shù)的減少可以作為胃癌發(fā)病風(fēng)險的一項指標(biāo)[33]。類似的結(jié)果，韓琤波等利用PCR和聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)銀染分析20例胃癌組織mtDNA D-loop區(qū)的HVRⅠ和HVRⅡ，表明HVRⅠ和HVRⅡ的拷貝數(shù)在癌組織中明顯降低，由此認(rèn)為胃癌與細胞內(nèi)mtDNA拷貝數(shù)的降低有密切關(guān)系，mtDNA可能會成為一種新興的腫瘤分子標(biāo)志物[34]。然而，Lee等報道,胃癌組織較癌旁組織mtDNA的拷貝數(shù)高，但兩者間差異并無統(tǒng)計學(xué)意義，也并未發(fā)現(xiàn)mtDNA拷貝數(shù)與胃癌的臨床病理特征之間存在關(guān)聯(lián)[35]。人類線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)由核基因TFAM編碼，在mtDNA轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和包裝成類核中起重要作用，在線粒體生物發(fā)生過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[36]。TFAM可通過維持mtDNA的穩(wěn)定性來調(diào)節(jié)mtDNA拷貝數(shù)，通過TFAM與mtDNA的相互作用來調(diào)節(jié)線粒體的生物發(fā)生[37]。Lee等采用TFAM-siRNA感染胃癌細胞MKN45敲低癌細胞中的TFAM水平，并通過定量PCR檢測mtDNA拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)敲減TFAM會降低mtDNA拷貝數(shù)水平，進而通過TFAM-mtDNA-Ca2+-CFAP65-PCK1軸參與線粒體逆行信號傳導(dǎo)，影響胃癌細胞的分化，下調(diào)胃癌細胞的增殖，提出消耗mtDNA將是針對TFAM相關(guān)胃癌的有效治療方法[38]。

3 mtDNA變異導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機制

mtDNA損傷引發(fā)癌變的機制非常復(fù)雜，盡管在多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)mtDNA的改變，但其致癌的具體機制仍未明確。作為細胞內(nèi)主要供能場所，線粒體可消耗人體95%以上氧量，在氧化磷酸化過程中有2%～4%的氧轉(zhuǎn)化成ROS，NADPH氧化酶1(Nox1)也會產(chǎn)生大量的ROS[39]。一般情況下，這些ROS能夠被機體自身的抵御系統(tǒng)及時清除，但當(dāng)自身的抵御系統(tǒng)功能減弱或ROS生成過多時，ROS未被清除而累積在細胞內(nèi)，就會損傷mtDNA從而導(dǎo)致mtDNA發(fā)生突變；mtDNA突變又會導(dǎo)致呼吸鏈酶編碼基因異常，影響呼吸鏈中電子傳遞的過程，減弱呼吸功能，產(chǎn)生大量內(nèi)源性的ROS，從而引發(fā)惡性循環(huán)；大量的ROS還可誘發(fā)原癌基因成為癌基因，還可刺激腫瘤細胞不斷增殖，以上這種機制被認(rèn)為參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[40]。

目前，已經(jīng)在多種癌癥中發(fā)現(xiàn)mtDNA含量減少伴隨p53的突變。作為一種重要的腫瘤抑制轉(zhuǎn)錄因子，在ROS造成mtDNA損傷時，p53能夠抑制腫瘤形成，且進入線粒體作用于mtDNA聚合酶，增強mtDNA的復(fù)制能力，因此p53的突變或缺失會造成mtDNA含量減少[41]。Yeung等在膠質(zhì)母細胞瘤細胞系中鑒定了大量的mtDNA突變體，發(fā)現(xiàn)mtDNA突變體的積累會導(dǎo)致電子轉(zhuǎn)移鏈功能失調(diào)，從而促進細胞由有氧糖代謝轉(zhuǎn)變?yōu)闊o氧糖酵解，導(dǎo)致腫瘤細胞的增殖[42]。

另外，mtDNA的片段也可能通過整合到nDNA中的方法參與腫瘤的形成。細胞受到有害刺激時，線粒體發(fā)生崩解，細胞質(zhì)中游離的mtDNA及其片段增多，如果此時機體不能及時清除游離mtDNA，在一定條件下這些游離mtDNA及其片段就會進入細胞核，與nDNA隨機整合，基因整合可導(dǎo)致核基因組不穩(wěn)定，使信號傳導(dǎo)異常，細胞增殖分化紊亂從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[43]。

4 展望

綜上所述，mtDNA變異在胃癌的形成及進展中發(fā)揮重要作用，這是由于mtDNA作為細胞核外唯一的遺傳物質(zhì)，具有獨特的自身結(jié)構(gòu)和特征，相比nDNA更易于發(fā)生氧化損傷和變異。然而，值得注意的是雖然在胃癌中發(fā)現(xiàn)了多種mtDNA突變，但仍未找到mtDNA突變與胃癌發(fā)生最具直接因果關(guān)系的有力證據(jù)；盡管已在包括胃癌在內(nèi)的多種類型腫瘤中發(fā)現(xiàn)mtDNA拷貝數(shù)變異，但究竟mtDNA含量的升高或降低是決定腫瘤發(fā)生發(fā)展的危險因素仍無明確定論。值得慶幸的是，目前針對mtDNA變異在基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用(實驗室常規(guī)檢測等)方面，現(xiàn)在已經(jīng)能夠利用CRISPR/Cas9技術(shù)進行基因編輯，定點敲除以實現(xiàn)mtDNA缺失類型的誘變；通過調(diào)節(jié)TFAM基因?qū)崿F(xiàn)對線粒體拷貝數(shù)的誘變，以此為臨床提供更多的思路。但在技術(shù)上仍然存在一定的局限性，尚無有效準(zhǔn)確的技術(shù)手段對mtDNA進行插入類型的誘變，在臨床上也無法開展大規(guī)模的mtDNA測序工作，缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的實驗室操作流程，這些均是mtDNA變異在包括胃癌等腫瘤研究和臨床應(yīng)用中所面臨的挑戰(zhàn)。最近Zhao等已率先構(gòu)建了靶向線粒體circRNA的納米遞送系統(tǒng)，實現(xiàn)了在體內(nèi)外干預(yù)線粒體定位circRNA，為靶向線粒體信號治療代謝性免疫疾病提供了新思路[44]。相信隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和進步，mtDNA變異在胃癌中發(fā)揮的作用及其相關(guān)機制也會逐漸清晰，對于胃癌靶向治療將提供更加具有針對性的方法。