張 翔，林婷婷，劉豐波，宋姍姍，李 彬，欒棟祖，王群義，劉 平，劉紅祥，馬 冬，任衍倍，劉 東，3

（1.青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266000；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東青島 266109；3.動(dòng)物基因工程疫苗國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266000）

禽戊型肝炎病毒（avain hepatitis E virus，aHEV）屬于肝炎病毒科正戊肝病毒屬B 種，是一種無(wú)囊膜的單股正鏈RNA 病毒[1]，主要流行4 個(gè)基因型：澳大利亞和韓國(guó)的基因1 型，美國(guó)的基因2 型，中國(guó)和歐洲的基因3 型，匈牙利和中國(guó)臺(tái)灣的基因4 型[2]。該病原引起的疾病最早可追溯到20 世紀(jì)80 年代澳大利亞、美國(guó)、加拿大等陸續(xù)報(bào)道的雞大肝大脾病（big liver and spleen disease，BLS）或肝炎脾大綜合征（hepatitis-splenomegaly，HS）[3-5]，2001 年確定病原并命名為禽戊型肝炎[6]。1994 年我國(guó)就有BLS 抗體陽(yáng)性的報(bào)告，2010 年和2014 年分別從肉種雞和蛋雞群中分離到aHEV[7-8]。

aHEV 多感染產(chǎn)蛋期雞群，病程為1～2 個(gè)月甚至更長(zhǎng)，臨床主要表現(xiàn)為死淘率升高（5%～15%）。剖檢可見(jiàn)，肝脾腫大、出血，卵泡萎縮變形等，后期易繼發(fā)細(xì)菌感染。為分析我國(guó)aHEV 基因變異情況，對(duì)2018 年從山東、河南、河北、遼寧、吉林、黑龍江、陜西、山西、江蘇等地疑似感染aHEV雞群中采集的肝臟、脾臟病料樣品進(jìn)行aHEV RTPCR 檢測(cè)，并對(duì)aHEV 陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行ORF1基因序列測(cè)定與遺傳進(jìn)化分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2018 年采集山東、河南、河北、遼寧、吉林、黑龍江、陜西、山西、江蘇9 個(gè)省份疑似aHEV 感染的雞肝臟、脾臟樣品共計(jì)679 份，無(wú)菌處理后，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 RNAout 提取試劑盒，購(gòu)自天恩澤生物公司；HiScript?II One Step RT-PCR Kit，購(gòu)自諾唯贊生物公司；DL 2 000 DNA Marker，購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 參照GenBank 已公布的aHEVORF1基因核苷酸序列，利用Oligo 6.0 軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增aHEV-ORF1基因的特異性引物（aHEV-ORF1-F：5'-FCGTCTCGCAGATAGCAGAGTCC-3'；aHEVORF1-R：5'-TATAGCCCATTCCCGCTCAATC-3'）。引物由北京華大基因科技有限公司合成，預(yù)期擴(kuò)增目的片段為750 bp。

1.2.2 病毒核酸提取 組織RNA 和DNA 提取，按核酸提取試劑盒和核酸提取儀說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.3 核酸擴(kuò)增 用RT-PCR 一步法試劑盒擴(kuò)增cDNA：45 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min；94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性40 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存10 min。PCR 產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

1.2.4ORF1基因序列分析 挑取陽(yáng)性樣品產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。用MegAlign 和Mega6.0 軟件，對(duì)測(cè)定的aHEVORF1基因序列與GenBank 中部分代表性毒株序列進(jìn)行同源性比較和遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR 檢測(cè)

對(duì)送檢的679 份樣品處理后進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè)，其中37 份樣品擴(kuò)增出750 bp 左右的目的片段（圖1），為aHEV 陽(yáng)性。將測(cè)序結(jié)果與GenBank比對(duì)，結(jié)果均為aHEV。

2.2 ORF1 基因同源性分析

圖1 部分樣品的RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果

從不同地區(qū)RT-PCR 陽(yáng)性樣品中，隨機(jī)選取15 個(gè)試驗(yàn)毒株ORF1核苷酸序列，利用MegAlign進(jìn)行同源性比較。結(jié)果（圖2）顯示：試驗(yàn)株之間ORF1基因同源性為90.1%～100%，而與基因1 型的澳大利亞株和韓國(guó)株同源性為 85.5%～89.0%，與基因2 型的美國(guó)原型株和美國(guó)無(wú)毒株同源性為85.5%～88.2%，與基因3 型的歐洲株和中國(guó)株同源性為 86.3%～89.7%，與基因4 型的匈牙利株和中國(guó)臺(tái)灣株同源性為 86.4%～88.5%。

2.3 ORF1 基因遺傳進(jìn)化分析

利用Mega6.0 對(duì)15 株試驗(yàn)株的ORF1基因進(jìn)行序列比較，繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果（圖3）顯示：15 株aHEV 均屬于戊型肝炎B 種，形成獨(dú)立的基因分支，但不屬于已報(bào)道的4 個(gè)基因型（基因1～4 型）。

3 討論

目前國(guó)內(nèi)外都對(duì)aHEV 進(jìn)行了血清學(xué)和分子流行病學(xué)調(diào)查研究。我國(guó)南方雞群aHEV 血清陽(yáng)性率約為33%[9]，廣東、山東、黑龍江3 個(gè)省份的雞群血清陽(yáng)性率約為28.3%[10]。這些血清學(xué)調(diào)查結(jié)果均顯示，aHEV 已在我國(guó)雞群中廣泛流行。但血清學(xué)調(diào)查只能反映雞群的抗體水平，無(wú)法檢測(cè)雞群的病原感染情況，且病毒分離難度較大；而分子生物學(xué)方法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果直觀、敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，已被廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)。ORF1基因編碼aHEV 的多聚蛋白，包含甲基轉(zhuǎn)移化酶、解螺旋酶以及RNA 依賴的RNA 聚合酶[2]。它們是目前國(guó)內(nèi)外aHEV 的主要分型依據(jù)。

本研究通過(guò)RT-PCR 方法，對(duì)2018 年山東、河南、河北、遼寧、吉林、黑龍江、陜西、山西、江蘇等地區(qū)疑似aHEV 感染雞群的679 份肝臟和脾臟病料樣品進(jìn)行aHEV 檢測(cè)，結(jié)果檢出37 份陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性檢出率為5.45%，說(shuō)明我國(guó)雞群存在不同程度的aHEV感染，這應(yīng)引起養(yǎng)雞企業(yè)的高度重視。

圖2 aHEV-ORF1 基因部分序列同源性分析結(jié)果

圖3 aHEV-ORF1 基因遺傳進(jìn)化樹(shù)

通過(guò)對(duì)15 株aHEV 野毒株的ORF1基因進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)所檢出毒株均屬于B 種，但不屬于現(xiàn)已報(bào)道的4 個(gè)基因型，為新亞型。通過(guò)核苷酸同源性比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，15 株aHEV 野毒株與基因1～4 型的代表株同源性均低于90%，而15 株分離株之間的差異不大，同源性為90.1～100%。目前關(guān)于aHEV 新亞型的相關(guān)報(bào)道較少，本研究為我國(guó)aHEV 的分子流行病學(xué)分析提供了補(bǔ)充和參考。