王艷霞,王璐,楊俊換,張瑤

(山東理工大學(xué) 農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 255049)

早期研究表明，氮源限制是產(chǎn)脂微生物積累脂質(zhì)的重要營養(yǎng)特征，當(dāng)培養(yǎng)基中氮源耗盡后，細(xì)胞內(nèi)能荷升高，腺苷一磷酸(adenosine monophosphate，AMP)度降低，三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle,TCA cycle)受阻，此時胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等大分子的合成趨于停止，菌體不再生長，而培養(yǎng)基中大量的碳源(葡萄糖及其他被微生物吸收利用的糖類)持續(xù)吸收并轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)，引起胞內(nèi)脂質(zhì)大量積累[1-3]。至今，科學(xué)家們對微生物脂質(zhì)積累過程做了大量的研究工作，對產(chǎn)脂微生物氮源限制引發(fā)三羧酸循環(huán)調(diào)節(jié)到脂肪酸合成的生化機(jī)制有了較為清楚的認(rèn)識[3-4]。對真核生物而言，糖酵解的終產(chǎn)物——丙酮酸進(jìn)入線粒體內(nèi)，經(jīng)丙酮酸脫氫酶轉(zhuǎn)化為重要中間代謝產(chǎn)物——乙酰-CoA。線粒體內(nèi)乙酰-CoA必須轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞溶膠，才能用于脂質(zhì)合成[5-7]；因此，轉(zhuǎn)運(yùn)乙酰-CoA(檸檬酸為其乙?；d體)的線粒體三羧酸(檸檬酸)轉(zhuǎn)運(yùn)體系是連接糖代謝與脂質(zhì)合成的紐帶，是影響真核生物脂質(zhì)合成的一個重要因素[5-7]。

三羧酸(檸檬酸)轉(zhuǎn)運(yùn)體系中另一個重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)是蘋果酸(或二羧酸)轉(zhuǎn)運(yùn)體(malate transporter,MT)。對大鼠肝臟[8]、胰腺beta細(xì)胞[9]線粒體，以及從大鼠肝臟中分離、純化的二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)[10-11]的研究結(jié)果表明，該轉(zhuǎn)運(yùn)體通過電荷中性交換原則，在轉(zhuǎn)入磷酸鹽(或含硫化合物)的同時，將二羧酸(蘋果酸、琥珀酸)轉(zhuǎn)出線粒體用于糖異生。對釀酒酵母二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的研究[12-14]顯示，MT有可能通過轉(zhuǎn)入蘋果酸而增加線粒體內(nèi)檸檬酸的合成量，從而促進(jìn)線粒體檸檬酸的轉(zhuǎn)出。近年來，隨著全基因組測序與全外顯子測序等高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展[15]，大量新的基因序列及氨基酸序列被載入到生物數(shù)據(jù)庫中，促進(jìn)了生物信息學(xué)的繁榮。研究那些通過實(shí)驗(yàn)難以確定結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，利用生物信息學(xué)軟件對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行快速預(yù)測和分析，具有重要的理論意義和實(shí)用價值。

產(chǎn)脂真菌卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)是研究脂質(zhì)積累機(jī)制的模式生物，也是全球首次商業(yè)化生產(chǎn)微生物油脂的菌株，其生產(chǎn)的油脂富含ω-6多不飽和脂肪酸γ-亞麻酸[5-6]。目前關(guān)于產(chǎn)脂絲狀真菌檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能報道較少。本研究借助生物信息學(xué)分析技術(shù)對來源于卷枝毛霉的MT蛋白的理化特性、空間結(jié)構(gòu)及功能位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，為后續(xù)探究該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的三維結(jié)構(gòu)與功能奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 卷枝毛霉MT蛋白序列

根據(jù)JGI數(shù)據(jù)庫公布的卷枝毛霉CBS277.49的基因組信息，通過BLAST工具將基因組中全部基因序列與轉(zhuǎn)運(yùn)體系分類數(shù)據(jù)庫(TCDB)進(jìn)行比對，找到編碼卷枝毛霉MT蛋白的基因只有一個，通過BLAST工具在CBS277.49的基因數(shù)據(jù)庫(http://genome.jgi.doe.gov/pages/search-for-genes.jsf?organism=Mucci2)中查找CBS 277.49中的蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)體相關(guān)基因，序列如下：

MGEKLERKSLKEMVRHFTPSWFSVIMGTGILSILLHVFPFQFRGLQTIALVVYIMNVVMFCIFLIITIARYAIWPSIIRLVLEHSNQSLFIGTMPMGLTTITNFTILAIREKYAWGLNLAFVLWIIEYVLTILTVLVVPYFVIVHHNHALETMNGTWLLPIVPCVVASASGGLLAQYLDQDRALVVLVISIITMGMGLSLALSVIVIYFYRLIVNKLPPKEVIISSFLPLGPLGQGAYGVIQLGIASKAVLGDRFIVGLGDVAHSVGFLLALFLWGYGVWYLVVATFSVGITTKQGIPFNMGWWALTFPLGVFTAGTLSIGNVLNSMFFWVLGAIFTCLLVLLWLAVMAKTLKGIFTGEMFYAPCLSPVILNS

1.2 卷枝毛霉MT蛋白結(jié)構(gòu)分析

通過借助在線分析工具Protparam(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)對卷枝毛霉MT蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析；借助ProtScale(http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl)對 MT 蛋白的疏水性進(jìn)行分析。通過借助在線預(yù)測工具PredictProtein(http://www.predictprotein.org)和Sopma(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/)預(yù)測 MT 蛋白的二級結(jié)構(gòu)，借助在線分析網(wǎng)站(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)進(jìn)一步預(yù)測該蛋白的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。借助 SWISS-MODEl工具在線完成 MT 蛋白三級結(jié)構(gòu)模型的構(gòu)建。

1.3 卷枝毛霉MT蛋白功能預(yù)測

通過借助在線預(yù)測工具 SignalP-5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測 MT 蛋白的信號肽；借助在線分析工具TMHMMServer v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)對MT蛋白的跨膜特征進(jìn)行分析；借助 NCBI 網(wǎng)站上 Conserved Domains Search (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)工具分析 MT 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；借助在線分析工具NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)分析 MT 蛋白的磷酸化位點(diǎn)以及借助 Motif Scan(https://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)在線工具對 MT 蛋白翻譯后修飾位點(diǎn)及膜體位置進(jìn)行分析。

1.4 卷枝毛霉MT蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

利用卷枝毛霉MT蛋白序列在NCBI網(wǎng)站上借助BLAST工具進(jìn)行同源性分析，從中挑選出同源性較高的不同代表性物種的蛋白序列進(jìn)行多重序列比對，并使用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 卷枝毛霉MT蛋白的理化性質(zhì)

通過對卷枝毛霉中MT蛋白理化性質(zhì)的分析，得知該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的分子量約為41 247.79 Da，分子式為C1967H3062N454O475S18，等電點(diǎn)為9.14，不穩(wěn)定系數(shù)(Instability index)為24.01(Ⅱ級)，因此將該類蛋白歸類為相對穩(wěn)定的蛋白。該蛋白的氨基酸總數(shù)為373個，含量相對較高的氨基酸主要包括Leu(56個，15.0%)、Val(40個、10.7%)、Ile(38個、10.2%)、Gly(32個、8.6%)、Phe(25個、6.7%)、Ala(24個、6.4%)、Thr(23個、6.2%)，不含有Pyr和Sec兩類氨基酸，因此其脂肪族氨基酸指數(shù)偏高，約為135.82。該蛋白為膜蛋白，它的親水性總平均值為1.052，一般根據(jù)親水性總平均值的正負(fù)來判斷其親水性與疏水性(正值為疏水性，負(fù)值為親水性)，因此我們推斷這是一個疏水性蛋白。通過使用ProtScale工具對該蛋白的疏水性進(jìn)一步分析，結(jié)果表明MT蛋白的疏水性較強(qiáng)，利于它向內(nèi)部折疊形成二級結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步形成結(jié)構(gòu)域、三級結(jié)構(gòu)等，同時利于形成α螺旋，保證其穩(wěn)定性，符合其跨膜蛋白的特性(圖1)。

圖1 MT蛋白的疏水性/親水性預(yù)測Fig.1 Hydrophobic/hydrophilic prediction of MT protein

2.2 卷枝毛霉MT蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

對卷枝毛霉MT蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果(圖2)顯示，該蛋白中二級結(jié)構(gòu)為:α螺旋(藍(lán)色線條,193殘基)占比為51.74%、無規(guī)則卷曲(紫色線條，101殘基)占比為27.08%、延伸鏈(紅色線條，65殘基)占比為17.43%、β轉(zhuǎn)角(綠色線條，14殘基)占比為3.75%。α螺旋占比最高，是組成該MT蛋白的主要結(jié)構(gòu)。膜蛋白分子中，鑲嵌在膜內(nèi)的部分為α螺旋結(jié)構(gòu)。借助Phyre工具進(jìn)一步對跨膜螺旋結(jié)構(gòu)(圖3)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白總計(jì)有10處跨膜區(qū)，分別位于：19-36，48-72，87-107，119-141，156-176，186-221，225-242，263-290，303-321，329-358氨基酸位點(diǎn)處。

圖2 MT蛋白的二級結(jié)構(gòu)Fig.2 Secondary structure of MT protein

圖3 MT蛋白的跨膜螺旋拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)Fig.3 Transmembrane helical topology of MT protein

2.3 卷枝毛霉MT蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

卷枝毛霉MT蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果如圖4所示，可知該蛋白在N端以無規(guī)則卷曲和延伸的形式存在，中部由10個α螺旋和少量β轉(zhuǎn)角交替出現(xiàn)，C端以β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)束。整個模型是通過α螺旋和少量β轉(zhuǎn)角等二級結(jié)構(gòu)元素在三維空間的上述形式排列形成的一個接近于橢球形的蛋白質(zhì)分子的三維結(jié)構(gòu)。此蛋白分子由10個跨膜螺旋逆時針形成活性中心鑲嵌于膜內(nèi)的磷脂雙分子層之間，符合其跨膜蛋白的結(jié)構(gòu)。

圖4 預(yù)測的MT蛋白的三級結(jié)構(gòu)Fig.4 Predicted tertiary structures of MT protein

2.4 卷枝毛霉MT蛋白的分析

通過使用SignalIP 3.0 Server工具Neural Networks(NN)程序?qū)碇γ筂T蛋白的信號肽進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Cleavage site score(C-score)沒有明顯特征、Signal peptide score(S-score)在40殘基處有高的分值；但綜合分析信號肽剪切分值并不高，因此預(yù)測該蛋白不存在信號肽屬于非分泌型蛋白(圖5)。通過使用TMHMM工具對卷枝毛霉MT蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析(圖6)，發(fā)現(xiàn)該蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域的位置為：20-42，52-74，87-109，122-144，156-178，188-210，223-245，265-287，299-321，326-348氨基酸位點(diǎn)處，符合其跨膜蛋白的特性。TMHMM工具對卷枝毛霉MT蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域的位置預(yù)測與上述Phyre工具的位點(diǎn)稍有偏差，但跨膜區(qū)域總數(shù)相一致。

圖5 MT蛋白的信號肽分析Fig.5 Signal peptide analysis of MT protein

圖6 MT蛋白的跨膜區(qū)分析Fig.6 Transmembrane analysis of MT protein

2.5 卷枝毛霉MT蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測

通過使用NCBI網(wǎng)站上的Conserved domains分析可知，卷枝毛霉MT蛋白的保守結(jié)構(gòu)域有一個(圖7)，預(yù)測結(jié)果顯示該蛋白中14-348氨基酸屬于亞硒酸鹽抗性/二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(TDT)家族。含有門控離子通道中的苯丙氨酸，與亞硫酸鹽敏感蛋白(SSU1)保守結(jié)構(gòu)域一致。

圖7 MT蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.7 Conservative domain analysis of MT protein

2.6 卷枝毛霉MT蛋白翻譯后修飾與結(jié)構(gòu)的特征性序列分析

通過對卷枝毛霉MT蛋白理化性質(zhì)的分析可知，絲氨酸(Ser)及蘇氨酸(Thr)不是其主要組成，含量較低，故此推測該蛋白的磷酸化位點(diǎn)較少。通過借助NetPhos 2.0 Server分析工具進(jìn)一步預(yù)測的結(jié)果表明，MT蛋白潛在的Ser磷酸化位點(diǎn)有3個，潛在的Thr磷酸化位點(diǎn)有2個，無潛在的酪氨酸(Tyr)磷酸化位點(diǎn)。

不同的翻譯后修飾類型都可能影響蛋白的基本性質(zhì)進(jìn)而影響其功能，借助Motif Scan程序分析卷枝毛霉MT蛋白翻譯后修飾位點(diǎn)及膜體位置見表1。由表1可知：該蛋白存在3個ASN-糖基化位點(diǎn)，分別位于氨基酸86-89、103-106、154-157處；8個豆蔻?；稽c(diǎn)，分別位于氨基酸116-121、171-176、195-200、296-301、311-316、321-326、333-338、354-359處；1個酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)，位于氨基酸9-12處；3個蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，分別位于氨基酸9-11、291-294、351-353處。同時在氨基酸19-316處存在一個C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體/MT蛋白保守結(jié)構(gòu)域，概率值為4.8e-89，與功能域預(yù)測的結(jié)果一致。

2.7 卷枝毛霉MT蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹分析

借助網(wǎng)站NCBI中的Blast工具將卷枝毛霉MT蛋白與其他物種中的MT蛋白進(jìn)行同源性分析隨后生成系統(tǒng)發(fā)育樹(圖8)。結(jié)果顯示卷枝毛霉CBS277.49與毛霉菌(Mucorambiguous)的同源性最高，其次與卷枝毛霉WJ11也有很高的同源性，因此聚為一類；與栽培大豆(Cultivatedsoybeans)和植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)兩個物種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 結(jié)束語

本研究借助生物信息學(xué)分析技術(shù)對產(chǎn)脂絲狀真菌卷枝毛霉的MT蛋白進(jìn)行多方面預(yù)測。經(jīng)分析推斷可知，該蛋白疏水性強(qiáng)且性質(zhì)穩(wěn)定，不存在明顯的信號肽特征，屬于非分泌型蛋白。α螺旋是組成該MT蛋白占比最高的二級結(jié)構(gòu)，并且膜蛋白分子中α螺旋結(jié)構(gòu)是鑲嵌在膜內(nèi)的部分[6]，符合該蛋白跨膜運(yùn)輸?shù)奶匦?。MT蛋白由10個跨膜螺旋逆時針排列形成一個接近于橢球形的蛋白質(zhì)分子的三維結(jié)構(gòu)。對MT蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，該蛋白存在一個C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體/MT蛋白保守結(jié)構(gòu)域。該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白磷酸化位點(diǎn)、翻譯后修飾與結(jié)構(gòu)的特征性序列分析顯示其潛在的Ser磷酸化位點(diǎn)有3個，潛在的Thr磷酸化位點(diǎn)有2個，無潛在的Tyr磷酸化位點(diǎn)；有8個豆蔻?；稽c(diǎn)，3個ASN-糖基化位點(diǎn)和蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，1個酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)卷枝毛霉MT蛋白與毛霉菌(Mucorambiguous)的同源性最高，聚為一類，與植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。本研究將為后續(xù)探究MT蛋白的三維結(jié)構(gòu)與功能奠定基礎(chǔ)。

表1 MT蛋白翻譯后修飾位點(diǎn)預(yù)測Tab.1 Post-translational modification site prediction of MT protein

圖8 不同種屬的MT蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.8 Phylogenetic tree of MT protein system from different species